杜潤(rùn)元, 廖 穎, 馬丹煒, 朱曉換, 王亞男

(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101)

加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的體外抗腫瘤活性初探

杜潤(rùn)元, 廖 穎*, 馬丹煒, 朱曉換, 王亞男

(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101)

為了探討加拿大蓬揮發(fā)油的體外抗腫瘤活性,采用MTT比色法探究揮發(fā)油對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用,并采用AO/EB染色法觀察Hela細(xì)胞在揮發(fā)油作用下的形態(tài)變化.結(jié)果表明:加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用,細(xì)胞活力隨著處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,其中處理8、24和48 h的IC50分別是22.72、18.06和6.78 mg/L,在加入泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)后,這種抑制作用得到緩解,24 h的IC50上升至29.9 mg/L,表明該揮發(fā)油可能激活了Hela細(xì)胞中的caspase蛋白酶活性.AO/EB染色觀察發(fā)現(xiàn),加拿大蓬揮發(fā)油處理Hela細(xì)胞后使其呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)的特征.由此推斷,加拿大蓬揮發(fā)油可能是通過誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡來抑制細(xì)胞增殖.

加拿大蓬; 揮發(fā)油; Hela細(xì)胞; 增殖抑制作用; 細(xì)胞凋亡

含有揮發(fā)油成分的植物資源在自然界中分布廣泛,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多植物揮發(fā)油具有顯著的抗腫瘤活性,它們能通過各種不同的作用機(jī)制抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[1-2],因此以揮發(fā)油為研究對(duì)象,將其開發(fā)為抗癌藥物具有巨大市場(chǎng)前景和理論意義.隨著人們對(duì)癌癥研究的深入和對(duì)抗癌藥物的開發(fā),許多來源于植物的抗腫瘤有效成分相繼被發(fā)現(xiàn),揮發(fā)油也成為目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn).經(jīng)過一些學(xué)者的前期研究,右旋檸檬烯(d-limonene)正在進(jìn)行臨床Ⅰ期實(shí)驗(yàn)[3],紫蘇醇(Perillyl alcohol)也到了臨床Ⅱ期的研究階段[4].β-欖香烯(β-elemene)在我國(guó)已研發(fā)為二類抗腫瘤新藥——欖香烯乳注射液,目前已廣泛用于治療食道癌、肺癌、腦腫瘤以及其他各類癌癥[5].加拿大蓬(ErigeronCanadensisL.),別名小飛蓬草、白酒草,一年生草本植物,菊科白酒草屬,原產(chǎn)于北美,具備極強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和入侵性[6],已大面積入侵我國(guó)多個(gè)省市[7].加拿大蓬揮發(fā)油具有多種生物活性,如具有明顯的抗炎抗蟲、殺菌抗病毒、抗凝血等效果[8].加拿大蓬由于具有較強(qiáng)的入侵性而在我國(guó)廣泛分布,資源豐富,如能開發(fā)其藥用價(jià)值而為人類所用,在一定程度上可控制其進(jìn)一步蔓延,起到趨利避害的作用.本研究以加拿大蓬揮發(fā)油為材料,旨在初步探索其抑制離體培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖效果及可能的機(jī)制,為加拿大蓬開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 受試植株加拿大蓬采自于成都市龍泉驛區(qū);人宮頸癌Hela細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院提供;改良型1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生化制品有限公司);新生牛血清(天杭生物科技有限公司);胰蛋白酶消化液(成都哈里生物公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Biosharp生物公司);二甲基亞砜(DMSO,Amresco生化公司);泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK,Eyotime Biotechnology公司);氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,中國(guó)食品藥品檢定研究院);吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB,Biosharp生物公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取 加拿大蓬揮發(fā)油采用水蒸氣蒸餾法提取,把整株加拿大蓬切成小段,放于揮發(fā)油提取器加熱,蒸汽冷凝回流,收集揮發(fā)油,用無(wú)水Na2SO4過濾除水,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含10%小牛血清、1%青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基,于37 ℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2 d傳代一次,細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn).

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 胰酶消化Hela細(xì)胞后離心,稀釋細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL,按每孔100 μL接種于96孔板,放于培養(yǎng)箱中孵育過夜,細(xì)胞貼壁后,處理組加入經(jīng)DMSO稀釋為不同濃度的加拿大蓬揮發(fā)油2 μL,每孔補(bǔ)加98 μL培養(yǎng)基,使揮發(fā)油的最終質(zhì)量濃度分別為0(溶劑對(duì)照)、12.5、25、50、100 mg/L;陽(yáng)性對(duì)照組加入2 μL氟尿嘧啶(FU,終濃度80 mg/L)補(bǔ)加98 μL培養(yǎng)基;空白對(duì)照加入100 μL 1640培養(yǎng)基,調(diào)零組加入200 μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)基;每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)重復(fù).分別繼續(xù)培養(yǎng)8、24和48 h后,每孔加入20 μL 5 g/L的MTT試劑(調(diào)零組不加MTT),繼續(xù)培養(yǎng)4 h;小心吸除培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,置于多功能酶標(biāo)儀內(nèi),震蕩5 min,調(diào)零孔調(diào)零后,在490 nm下測(cè)吸光度值(OD值).按公式:細(xì)胞活力%=(OD處理組/OD溶劑對(duì)照組)×100%,計(jì)算細(xì)胞活力,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.以揮發(fā)油濃度作為橫坐標(biāo),細(xì)胞活力作為縱坐標(biāo),作線性回歸曲線,根據(jù)擬合公式計(jì)算半抑制濃度IC50.

1.2.4 泛caspase抑制劑對(duì)揮發(fā)油抑制效果的影響 按1.2.3實(shí)驗(yàn)方法接種細(xì)胞,細(xì)胞貼壁后,除調(diào)零組外,每孔加入泛caspase抑制劑 (Z-VAD-FMK)30 μm于CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min后,再加入不同濃度加拿大蓬揮發(fā)油,每孔補(bǔ)加培養(yǎng)基98 μL,使揮發(fā)油的終質(zhì)量濃度分別為0(溶劑對(duì)照)、12.5、25、50和100 mg/L;陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照均按1.2.3方法設(shè)定,測(cè)定OD值后,計(jì)算細(xì)胞的活力.

1.2.5 AO/EB熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用胰酶消化離心,稀釋細(xì)胞至1×105個(gè)/mL,取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板,培養(yǎng)過夜,細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的加拿大蓬揮發(fā)油溶液,使其最終質(zhì)量濃度分別為0(溶劑對(duì)照)、12.5、25、50和100 mg/L;陽(yáng)性對(duì)照組加入FU(80 mg/L).培養(yǎng)24 h后,胰酶消化后收集全部細(xì)胞,用PBS洗滌后離心倒棄PBS,再加100 μL PBS制成細(xì)胞懸液,加入2 μL AO/EB染液,充分混勻,染色2 min,取10 μL滴在載玻片上,輕蓋蓋玻片,鏡檢拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響 Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度加拿大蓬揮發(fā)油處理不同時(shí)間后,細(xì)胞活力通過MTT法測(cè)定,溶劑對(duì)照組細(xì)胞活力為100%,以質(zhì)量濃度80 mg/L FU處理Hela細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照,與溶劑對(duì)照組相比,所有實(shí)驗(yàn)組均有顯著性差異(P<0.05).如圖1所示,加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞具有顯著的抑制細(xì)胞增殖作用,且隨著處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),Hela細(xì)胞生長(zhǎng)活力逐漸降低.8、24和48 h 處理組的IC50質(zhì)量濃度分別為22.72、18.06和6.78 mg/L.

2.2 泛caspase抑制劑對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油抑瘤活性的影響 未經(jīng)泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)預(yù)處理和經(jīng)泛caspase抑制劑預(yù)處理的Hela細(xì)胞,用不同濃度加拿大蓬揮發(fā)油處理24 h后,細(xì)胞活力通過MTT法測(cè)定,結(jié)果如圖2所示,在各濃度處理組中,未加泛caspase抑制劑與加泛caspase抑制劑相比,細(xì)胞活力均有顯著差異,*表示P<0.05,**表示P<0.01.經(jīng)泛caspase抑制劑處理,質(zhì)量濃度12.5 mg/L揮發(fā)油處理Hela細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力從66.44%上升到86.38%;其他質(zhì)量濃度處理其細(xì)胞活力從29.5%、9.31%、5.63%分別上升到49.17%、26.68%、14.27%(P<0.05).經(jīng)過泛caspase抑制劑處理后,加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果明顯降低.說明泛caspase抑制劑能明顯緩解加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的抑制,加拿大蓬揮發(fā)油可能誘導(dǎo)了Hela細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.

2.3 加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響 圖3中,A、B、C、D揮發(fā)油處理質(zhì)量濃度分別為0、12.5、50、100 mg/L,處理時(shí)間為8 h;F、G、H、I揮發(fā)油處理質(zhì)量濃度分別為0、12.5、50、100 mg/L,處理時(shí)間為24 h;K、L、M、N揮發(fā)油處理質(zhì)量濃度分別為0、12.5、50、100 mg/L,處理時(shí)間為48 h;E、J、O質(zhì)量濃度分別為80 mg/L FU處理8、24、48 h.圖3中箭頭表示凋亡小體.如圖3所示,加拿大蓬揮發(fā)油處理Hela細(xì)胞8、24、48 h,經(jīng)AO/EB著色后,對(duì)照組全為著色均勻、圓形或橢圓形的活細(xì)胞(圖3A、F、K);12.5 mg/L處理組出現(xiàn)著色不均勻的早期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核皺縮、核內(nèi)見明亮斑點(diǎn),并出現(xiàn)凋亡小體(圖3B、G、L);50 mg/L處理細(xì)胞核進(jìn)一步固縮,染色質(zhì)皺縮裂解,凋亡小體數(shù)升高(圖3C、H、M);100 mg/L處理組幾乎全為晚期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核畸變、碎裂(圖3D、I、N).隨著揮發(fā)油處理濃度升高和處理時(shí)間增加,正常Hela細(xì)胞減少,凋亡細(xì)胞增多.

3 討論

許多植物的揮發(fā)油對(duì)癌細(xì)胞增長(zhǎng)有明顯的抑制效果.如莪術(shù)[Curcuma(zedoaria) Christm Rosc.]揮發(fā)油及其3種成分能顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[9];姜黃(CurcumalongaL.)揮發(fā)油能抑制人白血病細(xì)胞HL260和人肝癌細(xì)胞HepG2的增長(zhǎng)[10],本研究結(jié)果表明,加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有明顯的抑制效應(yīng),隨著揮發(fā)油濃度增高和處理時(shí)間延長(zhǎng),這種抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng),表現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間雙重效應(yīng),其處理8、24、48 h的IC50分別為22.72、18.06和6.78 mg/L.與李美[11]對(duì)野胡蘿卜(DaucuscarotaL.)揮發(fā)油處理人宮頸癌Hela細(xì)胞6、12、24 h的IC50質(zhì)量濃度183.88、108.22、99.58 mg/L相比,加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于野胡蘿卜揮發(fā)油.與陽(yáng)性對(duì)照FU相比,加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的抑制效果更強(qiáng).由此可見,加拿大蓬揮發(fā)油中具有抗腫瘤活性物質(zhì).根據(jù)楊莉[12]對(duì)加拿大蓬揮發(fā)油成分分析表明,檸檬烯的含量超過一半,檸檬烯對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制效應(yīng),臨床上已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期試驗(yàn)[3],本研究中加拿大飛蓬揮發(fā)油所表現(xiàn)出的對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用是否是因其含有檸檬烯還有待進(jìn)一步探索.

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到外界刺激后,由特定基因控制和一系列蛋白參與的主動(dòng)死亡過程,主要表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮碎裂,染色質(zhì)凝聚,出現(xiàn)凋亡小體[13].在細(xì)胞凋亡過程中,天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(caspase)起重要作用[14].Z-VAD-FMK能阻斷凋亡,是一種能透過細(xì)胞膜不可逆轉(zhuǎn)的泛caspase抑制劑[15].本研究表明Z-VAD-FMK預(yù)處理能有效降低加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用,由此推測(cè)加拿大蓬揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制作用可能是通過激活caspase蛋白酶,從而引起細(xì)胞凋亡.AO/EB雙染結(jié)果表明,Hela細(xì)胞經(jīng)加拿大蓬揮發(fā)油處理后,細(xì)胞皺縮、染色加深、并出現(xiàn)凋亡小體,隨著處理質(zhì)量濃度的增加,晚期凋亡細(xì)胞數(shù)增加.

由此可見,加拿大蓬揮發(fā)油可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增長(zhǎng).由于加拿大蓬揮發(fā)油是混合物,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,本研究室將對(duì)其抗腫瘤主效成分及其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行深入研究.

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(編輯 鄭月蓉)

Primary Studies on in Vitro Antitumor Activities of Essential Oil fromErigeronCanadensisL. on Hela Cells

DU Runyuan, LIAO Ying, MA Danwei, ZHU Xiaohuan, WANG Yanan

(College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan)

To investigate the anti-tumor activity of the essential oil fromErigeronCanadensisL., the inhibitory effect of the oil was studied by MTT assay on human cervical cancer Hela cells. The morphologic changes in Hela cells induced by the essential oil were observed by AO/EB staining. The results showed that: the essential oil inhibited HeLa cells’ proliferation significantly in a dose and time -dependent manner. The IC50of essential oil on Hela cells for 8,24,48 h were 22.72,18.06,6.78 mg/L. The inhibitory effect was relieved after adding the pan-caspase inhibitor (Z-VAD-FMK), and IC50was increased to 29.9 mg/L at 24 h, indicating that the essential oil may activate the caspase in Hela cells. Typical morphologic changes of apoptosis were observed after the treatment with the essential oil fromErigeronCanadensisL. in Hela cells by using AO/EB staining. By inference, the essential oil fromErigeronCanadensisL.. may inhibit the proliferation of Hela cells possibly by inducing apoptosis.

ErigeronCanadensisL.; essential oil; Hela; proliferation inhibition; apoptosis

2015-07-17

四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(14ZA0024)

R737.33

A

1001-8395(2016)06-0911-04

10.3969/j.issn.1001-8395.2016.06.025

*通信作者簡(jiǎn)介：廖 穎(1976—),女,副教授,主要從事植物提取物抗腫瘤活性及環(huán)境生態(tài)與健康的研究,E-mail:421135278@qq.com