張艷萍　錢　鑫　李翠玲

廣東省佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東　佛山　528051

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UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)5種PDE5 型抑制劑的研究

張艷萍錢鑫李翠玲

廣東省佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東佛山528051

【摘要】目的：建立同時(shí)測(cè)定壯陽(yáng)類中成藥和保健品中可能添加的5種5型磷酸二酯酶(PDE5)型抑制劑UPLC-MS/MS分析方法，方法：采用液質(zhì)聯(lián)用法 ，應(yīng)用C(18)柱，流動(dòng)相為含0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脫，質(zhì)譜采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。 結(jié)果：5種PDE5 型抑制劑線性關(guān)系、精密度均符合方法學(xué)測(cè)定要求，加標(biāo)回收率為80.8%～101.9%。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)便、快捷、高靈敏度、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)中成藥和保健食品中非法添加多種PDE5 型抑制劑進(jìn)行定性定量分離檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】UPLC-MS/MS；壯陽(yáng)類中成藥；保健食品；PDE5 型抑制劑

近年來(lái)，一些不法商販利欲熏心，不擇手段，在宣傳具有抗疲勞功效的中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)藥品，其中以添加西地那非、他達(dá)那非和伐地那非這3種藥物較為常見(jiàn)[1]，在沒(méi)有醫(yī)師指導(dǎo)的情況下，長(zhǎng)期大量服用這種非法添加了“壯陽(yáng)”藥物成分的中成藥和保健食品，有可能對(duì)身體造成極大損害。若服用過(guò)量，極易引發(fā)毒副作用,會(huì)出現(xiàn)頭暈、昏暈、甚至青光眼，造成對(duì)腎功能、心臟功能、心血管疾病的嚴(yán)重?fù)p害。目前，中成藥和保健食品中非法添加壯陽(yáng)藥物檢驗(yàn)方法主要有液相色譜法[2-4]和液質(zhì)聯(lián)用法[5-6]，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布了藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件編號(hào)2009030補(bǔ)腎壯陽(yáng)類中成藥中PDE5 型抑制劑的快速檢測(cè)方法，主要采用理化反應(yīng)法、液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用(一級(jí)、二級(jí)掃描法)來(lái)對(duì)中成藥和保健食品中非法添加的PDE5 型抑制劑進(jìn)行定性。而本文采用UPLC-MS/MS多反應(yīng)檢測(cè)方法對(duì)中成藥和保健食品中非法添加的那紅地那非、紅地那非、西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非進(jìn)行定性和定量，該方法具有準(zhǔn)確、可靠、靈敏度更高，可為分析檢測(cè)中成藥和保健食品領(lǐng)域的打假行動(dòng)提供準(zhǔn)確可靠的技術(shù)保障。

1儀器與試劑

美國(guó)Waters xevo TQ 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀;美國(guó)MS2漩渦振搖器;瑞士梅特勒-托利多AB265-S電子天平;昆山KQ-250B超聲波清洗器。對(duì)照品那紅地那非(批號(hào)520039-201401)、紅地那非(批號(hào)520039-201401)、枸櫞酸西地那非、硫代艾地那非(批號(hào)250048-201401)、偽伐地那非(批號(hào)520041-201401)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水。

2方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的配制

2.1.1對(duì)照品混合標(biāo)儲(chǔ)備溶液的制備分別稱取上述5種對(duì)照品各約10mg，加乙腈溶解并定容至20ml容量瓶，濃度為0.5mg/ml的對(duì)照品單標(biāo)儲(chǔ)備溶液。

2.1.2對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備精密量取各單標(biāo)物質(zhì)適量，用20%乙腈溶液稀釋成不同濃度的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度范圍為0.2～5.0μg/ml。

2.1.3對(duì)照品混合使用溶液系列的制備準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml至5ml容量瓶，用20%乙腈水溶液定容，配制濃度范圍為0.004～0.50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。

2.2供試品溶液的制備精密稱取供試品約0.50g于25ml容量瓶中，加20%乙腈水溶液定容，旋渦振蕩2min后，超聲處理15min，過(guò)濾，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，待測(cè)，如樣品濃度超出線性，需對(duì)供試品溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2.3色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1色譜條件色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)，流動(dòng)相為乙腈 (A)-含0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫：0.0min,20% A;0.0～4.9min,20%～ 70%A;4.9～5.0min,70%～95%A;5.0～7.0min, 95%A; 7.0～7.1min ,95%～ 20%A; 7.1～10min ,20% A; 柱溫：40℃, 流速：0.30 ml/min, 進(jìn)樣量：1μ1。2.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子檢測(cè),離子源溫度: 150℃,毛細(xì)管電壓：3.5KV，脫溶劑溫度：500℃，錐孔氣流量(氮?dú)?：50L/h；碰撞氣流速(氬氣)：0.15 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，其各物質(zhì)母離子、定量離子、錐孔電壓、碰撞電壓見(jiàn)表1,MRM 離子流圖見(jiàn)圖1。

表1　5種PDE5 型抑制劑母離子、定量離子等

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性試驗(yàn)取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀，以峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，各物質(zhì)濃度在各自濃度范圍內(nèi)線性良好。按照樣品稱樣量0.5g,定容10ml，以儀器3倍噪聲值表示方法檢出限，10倍噪聲值表示方法定量限來(lái)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　5種PDE5 型抑制劑的線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)向一份未檢出上述5種PDE5 型抑制劑的中成藥中添加低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2進(jìn)行樣品處理，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，計(jì)算精密度和回收率。結(jié)果表明：5種PDE5 型抑制劑加標(biāo)回收率為80.8%～101.9%,RSD為2.0%～5.1%,均能滿足方法學(xué)要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品中5種PDE5 型抑制劑回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6方法應(yīng)用在本實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)監(jiān)督抽驗(yàn)的市售42批中成藥和25批保健食品進(jìn)行上述5種PDE5 型抑制劑的檢測(cè)，在20份中成藥和17批保健食品中檢出西地那非，含量為34.1～956.4mg/kg，檢出率為55.2%。

3討論

本實(shí)驗(yàn)選擇了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液系統(tǒng)，考察了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)物質(zhì)分離、色譜峰拖尾等影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加甲酸可以提高ESI電離源正離子檢測(cè)方式下的質(zhì)譜響應(yīng)，有利于改善峰形，且分離效果最好，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)，嘗試不同的流動(dòng)相比例的梯度程序，確認(rèn)使用前述梯度條件，各物質(zhì)峰型較好，并在6min內(nèi)5種物質(zhì)能分離完全。同時(shí)為減少溶劑效應(yīng)，提取溶劑選擇20%乙腈水溶液。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同類型不同長(zhǎng)度的色譜柱，最終選擇waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，其保留時(shí)間適中，具有較好的分離效能，不易受到干擾。由于中成藥和保健食品成分復(fù)雜，存在眾多干擾物質(zhì)，單純采用HPLC法較難將待測(cè)物質(zhì)與干擾物質(zhì)完全分離，本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS多反應(yīng)檢測(cè)方法可同時(shí)用于中成藥和保健食品中非法添加的壯陽(yáng)類藥物的定性和定量檢測(cè)，分析方法靈敏，線性范圍寬，精密度高，回收率好，這些因素保證該法用于中成藥和保健食品中PDE5 型抑制劑的分析能排除背景干擾，為打擊中成藥和保健食品中非法添加PDE5 型抑制劑的監(jiān)督檢驗(yàn)提供技術(shù)保障。

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Simultaneous determination of five phosphodiesterase type 5 ( PDE5) inhibitors by UPLC-MS/MS

ZHANG YanpingQIAN XinLI Cuiling

Foshan Institute for Drug and Food Control,Foshan 528051,China

Abstract:Objective To establish a UPLC-MS/MS analytical method for the simultaneous analysis of five PDE5 inhibitors in Chinese trandition medicines and Health Food.Methods The separation was performed on C(18) column using a gradient elution(0.1% formic acid in water and acetonitrile). A triple quadrupole mass spectrometer operating in positive electrospray ionization mode with multiple reaction monitoring was used.Results five PDE5 inhibitors have good linear relationship and precision according to the requirements of the methodology determination. The recoveries were 80.8%～101.9%.Conclusion the method not only isconvenient,rapid,sensitive and accurate ,but also can be used to separate and detect a variety of PDE5 inhibitors qualitatively and quantitatively in illegally added into anti-importence Chinese trandition medicines and health food at the same time .

Key words:UPLC-MS/MS;anti-impotence Chinese trandition medicines;health food;PDE5 inhibitor

(收稿日期：2016.02.01)

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)07-0021-02

作者簡(jiǎn)介：張艷萍(1979-)，女，碩士研究生，主管技師，研究方向?yàn)槭称罚幤罚瘖y品理化檢驗(yàn)工作。