張德蒙，婁茹云，王　雨，劉袖洞，于煒婷，馬小軍

(1. 中國科學院 大連化學物理研究所， 遼寧 大連 116023；

2. 大連大學環(huán)境與化學工程學院， 遼寧 大連 116622； 3. 中國科學院大學， 北京 100039)

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殼聚糖/siRNA納米粒的制備與性能研究*

張德蒙1,3，婁茹云1,3，王雨1,3，劉袖洞2，于煒婷1，馬小軍1

(1. 中國科學院 大連化學物理研究所， 遼寧 大連 116023；

2. 大連大學環(huán)境與化學工程學院， 遼寧 大連 116622； 3. 中國科學院大學， 北京 100039)

摘要：利用靜電自組裝法制備了殼聚糖/siRNA納米粒，建立了SYBR(? )Gold核酸染料法測定siRNA復(fù)合率(CR)，并系統(tǒng)性考察了n(N)/n(P)比，殼聚糖分子量(Mw)、脫乙酰度(DD)及制備環(huán)境pH值、緩沖液濃度(Bc)對納米粒siRNA復(fù)合率、粒徑及表面電位的影響規(guī)律。結(jié)果表明， siRNA復(fù)合率由n(N)/n(P) 0.5時的(18.6±4.0)%快速增大至n(N)/n(P)為2時的(92.9±2.0)%，但隨n(N)/n(P)增大復(fù)合率不再升高；n(N)/n(P)<2時，難以形成穩(wěn)定納米粒，復(fù)合物表面電位為負，n(N)/n(P)由5升至150時，納米粒粒徑由(179.3±5.7) nm 增大至(235.5±8.3) nm，表面電位由(17.2±1.3) mV升高至(23.6±0.9) mV。另外，n(N)/n(P) 150時，CR隨DD升高而升高，隨Bc升高而降低；納米粒粒徑隨Mw增大而增大，隨DD及緩沖液濃度(Bc)升高而減小；納米粒表面電位隨DD升高而升高，隨pH值及Bc升高而降低。n(N)/n(P)比對納米粒特性及siRNA復(fù)合率影響最為顯著，調(diào)整n(N)/n(P)、Mw、DD、pH值及離子強度可得到siRNA復(fù)合率在90%以上，粒徑100～300 nm，表面電位15～25 mV的納米粒。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；小干擾RNA；核酸染料；復(fù)合率

0引言

小干擾RNA (siRNA) 由21～23個堿基對構(gòu)成，可在細胞質(zhì)中特異性與其互補的信使RNA (mRNA)結(jié)合并使其降解，而阻斷蛋白質(zhì)的表達，即通過RNA 干擾(RNAi) 實現(xiàn)基因沉默。因此，siRNA作為藥物在癌癥、流感和炎癥等病毒感染疾病治療領(lǐng)域有重要科學意義和應(yīng)用價值[1-2]。然而，荷負電的親水性siRNA難以跨越荷負電的疏水性細胞膜，易被核酸酶降解及快速從血液循環(huán)中清除，因而需要安全高效的載體裝載保護，并將其遞送入細胞質(zhì)中引發(fā)RNAi[3-4]。殼聚糖(CS)是陽離子聚合物類siRNA載體中的一種，可生物降解，具有無毒、無刺激、無免疫原性、無致突變性等優(yōu)點，可在酸性條件下通過質(zhì)子化的氨基與siRNA磷酸基團間的靜電相互作用復(fù)合形成納米粒。因此，CS成為極具吸引力的siRNA載體[5]。盡管CS/siRNA體系在細胞水平實驗中獲得了很好的基因沉默效果，然而其在體內(nèi)的沉默實驗中獲得的結(jié)果并不理想[6-7]。

納米粒siRNA復(fù)合率、粒徑、表面電位等特性對入胞、轉(zhuǎn)運及siRNA釋放有重要影響，直接決定基因沉默的效果。其中，siRNA復(fù)合率(即復(fù)合態(tài)siRNA占總siRNA百分率)直接影響siRNA釋放動力學、最終沉默效果及殼聚糖材料優(yōu)化、成本核算等多個方面。目前siRNA復(fù)合率的檢測方法有凝膠電泳法、紫外吸收法、核酸染料法等[8-10]。凝膠電泳表征siRNA復(fù)合狀況，結(jié)果直觀明了，對比強烈，但實驗操作繁瑣，耗時長，同時也并非科學的定量方法。紫外吸收法定量siRNA復(fù)合率，需要通過離心、超濾等方法分離游離siRNA，可以實現(xiàn)精確定量，但分離操作繁瑣，且分離過程對siRNA復(fù)合狀態(tài)產(chǎn)生影響，最終導致得到的復(fù)合率結(jié)果準確性差。核酸染料法測定siRNA復(fù)合率，無需將納米粒分離，可以實現(xiàn)siRNA的原位檢測，重復(fù)性好，方便可靠[11]。因此，本文首次將SYBR? Gold核酸染料用于殼聚糖載siRNA體系中siRNA復(fù)合率的測定，通過調(diào)節(jié)殼聚糖氨基與siRNA磷酸基的n(N)/n(P)比，Mw、DD及制備環(huán)境pH值、Bc 3個方面的制備條件[6, 12]，系統(tǒng)性地考察這些因素對siRNA復(fù)合率、粒徑、表面電位等納米粒特性的影響規(guī)律。

1實驗

1.1實驗材料

殼聚糖(Mw：431 kDa，DD：90%)購自浙江金殼生物化學有限公司，經(jīng)實驗室純化后利用亞硝酸鈉降解及乙酸酐乙酰化反應(yīng)得到實驗用不同Mw、DD樣品。siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，正義鏈序列為5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3’，反義鏈序列為 5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。SYBR? Gold核酸染料由美國Molecular Probes 公司提供，焦碳酸二乙酯(DEPC)由美國 Amresco公司提供。實驗所有用水均使用DEPC滅RNA酶處理過的Millipore Milli-Q超純水。

1.2實驗方法

1.2.1殼聚糖溶液配制

考察n(N)/n(P)、Mw及DD對納米粒制備影響時，殼聚糖溶于濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液中，配制成濃度為1 mg/mL的溶液，并以濃度為10 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至pH值為5.5。

考察pH值對納米粒制備影響時，殼聚糖溶于濃度為0.2 mol/L的冰醋酸中，配制成濃度為1 mg/mL的溶液，以濃度為10 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)至pH值為6.2并取出1/3體積溶液備用。然后以冰醋酸調(diào)節(jié)剩余溶液至pH值為5.5，取出剩余溶液體積1/2備用。最后以冰醋酸繼續(xù)調(diào)節(jié)剩余溶液至pH值為4.5。

實驗通過控制緩沖液濃度(buffer concentration，BC)而獲得不同離子強度環(huán)境，殼聚糖分別溶于0.02，0.2及1.0 mol/L醋酸溶液中，配制成1 mg/mL溶液并以濃度為10 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)至pH值為5.5。

制備過程相應(yīng)條件緩沖液仿照殼聚糖溶液配制。后文若未有特殊說明，則納米粒制備條件為n(N)/n(P)=150，Mw=158 kDa，DD=80%，pH值=5.5，Bc=0.2 mol/L。

1.2.2CS/siRNA納米粒制備

根據(jù)設(shè)定的樣品n(N)/n(P)比，以相應(yīng)pH值、濃度的緩沖液對殼聚糖原液進行稀釋， 800 r/min磁力攪拌下緩緩加入濃度為20 μmol/L siRNA 20 μL，繼續(xù)攪拌10 min，即得CS/siRNA納米粒。

1.2.3粒徑及電位表征

應(yīng)用動態(tài)光散射法(DLS)測定納米粒粒徑，多普勒測速法(LDV)測定納米粒表面電位。檢測使用的儀器為英國馬爾文公司的Zetasizer?Nano ZS90，該設(shè)備激光器為633 nm波長的HeNe激光器。

1.2.4siRNA復(fù)合率測定

siRNA復(fù)合率(CR)采用SYBR? Gold核酸染料法測定。將納米粒加入檢測孔中，每孔50 μL，平行5孔。殼聚糖溶液為空白對照；siRNA溶液為siRNA游離對照。取2X SYBR? Gold工作液50 μL與納米?；旌?，避光震蕩20 min。隨后使用PerkinElmer公司LS-55熒光檢測器(美國)檢測495 nm激發(fā)，545 nm熒光發(fā)射強度并得出游離siRNA濃度，進而由式(1)計算得出siRNA復(fù)合率CR

(1)

其中，siRNAfree為測得的體系中游離siRNA的量，siRNAtotal為游離對照。

1.2.5統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，p值<0.05 被認為有顯著性差異(*)，p值<0.01 被認為有極顯著性差異(**)。

2結(jié)果與討論

CS/siRNA納米粒用于細胞水平的基因沉默，整個傳遞過程可以分為：入胞，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，siRNA釋放3個環(huán)節(jié)，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會降低最終的沉默效率[13-14]。siRNA的裝載過程決定了siRNA復(fù)合狀況以及納米粒粒徑、表面荷電性質(zhì)等物理特性。CS/siRNA粒徑及表面電荷直接決定了載體的入胞方式，而納米粒物理特性及入胞路徑又會共同影響其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運路徑[15, 16]。一旦納米粒被轉(zhuǎn)運入晚期溶酶體，CS/siRNA將面臨多種水解酶的降解甚至被排出胞外[14,17]。CS/siRNA入細胞前應(yīng)保持納米粒裝載siRNA穩(wěn)定性的同時，又要確保納米粒進入細胞后及時將siRNA釋放。如果siRNA進入細胞前就發(fā)生釋放，殼聚糖將失去載體應(yīng)有的保護作用；而如果納米粒進入細胞后未能及時將siRNA釋放，同樣無法發(fā)生RNAi。因此，siRNA釋放是伴隨整個傳遞過程的重要方面[18]， siRNA復(fù)合狀況則是決定釋放過程的基礎(chǔ)。

2.1n(N)/n(P)比對納米粒性質(zhì)的影響

n(N)/n(P)比指殼聚糖上氨基(N)與siRNA磷酸基團(P)的摩爾比。通常，制備體系中siRNA濃度是恒定的，n(N)/n(P)比的差異也可以理解為殼聚糖載體濃度的差異。由圖1(a)可知，當n(N)/n(P)由0.5升至2時，siRNA復(fù)合率由(18.6±4.0)%快速升高至(92.9±2.0)%，但隨n(N)/n(P)升高復(fù)合率不再變化。同時，n(N)/n(P)低于5時，CS/siRNA體系中并不能形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，測得的復(fù)合物表面電位亦為負值。n(N)/n(P)由5升至150時，殼聚糖/siRNA開始形成穩(wěn)定納米粒，粒徑由(179.3±5.7) nm 增大至(235.5±8.3) nm，表面電位由(17.2±1.3) mV升高至(23.6±0.95) mV(圖1(b)、(c))。CS/siRNA自組裝復(fù)合過程依賴殼聚糖上質(zhì)子化的氨基和siRNA磷酸基團間的靜電相互作用[19]。殼聚糖含量相對較低時，無法與siRNA穩(wěn)定結(jié)合形成納米粒，但是二者之間的靜電作用使得它們有松散的連接，siRNA附著在殼聚糖分子鏈上使其表面電位為負值，如圖1(c)中n(N)/n(P) < 2時的結(jié)果。在低n(N)/n(P)下，雖然無法形成穩(wěn)定的CS/siRNA納米粒，殼聚糖仍可與siRNA發(fā)生絡(luò)合，而使其無法與SYBR? Gold結(jié)合，因此n(N)/n(P)由0.5升至2時，siRNA復(fù)合率快速升至90%以上(圖1(a))。殼聚糖濃度繼續(xù)升高時，新增的殼聚糖不斷與siRNA層層纏繞包裹而形成穩(wěn)定的納米粒，納米粒粒徑與表面電位也隨之升高。此時，殼聚糖已經(jīng)處于過量狀態(tài)，但核酸染料仍可以與構(gòu)象變化較小或處于納米粒外部的siRNA結(jié)合，因此測得的siRNA復(fù)合率可以維持在90%以上的較高水平但無法達到100%(圖1(a))。研究表明，n(N)/n(P)比對納米粒裝載siRNA穩(wěn)定有重要影響。為了達到最佳的基因沉默效果，需要確保納米粒在進入細胞前保持siRNA處于受保護的狀態(tài)，通常n(N)/n(P)在30以上[20-21]。

圖1　n(N)/n(P)比對siRNA復(fù)合率、粒徑及電位的影響

2.2Mw及DD對納米粒性質(zhì)影響

Mw及DD是殼聚糖重要的兩個結(jié)構(gòu)參數(shù)。Mw、DD的變化會導致殼聚糖分子鏈長、氨基密度、分子內(nèi)及分子間作用力等的變化，并對殼聚糖分子構(gòu)象產(chǎn)生影響，進而影響CS對siRNA的裝載(siRNA復(fù)合率)及納米粒粒徑、表面電位特性[22-24]。如圖2(a)-(c)所示，Mw由43 kDa增大至319 kDa時，siRNA復(fù)合率無顯著變化，CR穩(wěn)定在92%上下，表面電位由(21.2±0.7) mV小幅波動至(22.5±1.2) mV，并無顯著性變化，而納米粒粒徑則由(180.4±4.1) nm快速增大至(278.5±3.6) nm。由圖2(d)-(f)可知，DD由67%升高至90%時，siRNA復(fù)合率自(86.9±1.5)%顯著升高至(94.3±0.1)%，納米粒粒徑由(317.5±6.0) nm大幅降低至(194.9±4.0) nm，同時表面電位則自(18.3±0.9) mV顯著升高至23 mV以上。

siRNA分子量為13 kDa，而殼聚糖的分子量在43～319 kDa，同時在高n(N)/n(P)比(150)條件下，大過量的殼聚糖可以充分纏繞包覆siRNA，使得siRNA復(fù)合率均在92%左右(圖2(a))。另外，Mw增大時，殼聚糖分子鏈柔性增強，更利于分子間的纏繞結(jié)合，因此納米粒粒徑會隨之增大(圖2(b))，這種構(gòu)象的變化同時也強化了殼聚糖纏繞結(jié)合siRNA的能力。Mw變化時，殼聚糖分子電荷密度并未發(fā)生變化，因此納米粒表面電位可以保持穩(wěn)定(圖2(c))。DD增大時，殼聚糖氨基密度升高，其與siRNA靜電作用力更為強烈，形成的納米粒更致密，納米粒粒徑隨之減小(圖2(e))。理論上，DD增大時，納米粒表面電位會因氨基密度的升高而升高，siRNA復(fù)合率也會因結(jié)合力的增大而增強。然而在n(N)/n(P) 為150條件下，大過量的殼聚糖會掩蓋這種理論上的變化，使得納米粒表面電位及siRNA復(fù)合率并未隨DD升高時出現(xiàn)大幅提高(圖2(d)、(f))。

圖2Mw、DD對納米粒粒徑、電位及siRNA復(fù)合率的影響

Fig 2 Influence ofMw andDDon nanoparticle size, zeta-potential andCR

2.3pH值及緩沖液濃度影響

pH值及Bc均可影響殼聚糖氨基的荷電狀態(tài)，而這種荷電狀態(tài)的變化除了直接影響CS/siRNA復(fù)合過程外，還可以通過改變殼聚糖構(gòu)象對復(fù)合過程產(chǎn)生影響。由圖3(a)-(c)可知，pH值由4.5增大至6.2時，siRNA復(fù)合率未見明顯變化，CR穩(wěn)定在約93%，納米粒粒徑由(209.2±2.2) nm增大至(216.0±3.2) nm，但并無統(tǒng)計學差異，而納米粒表面電位由(23.8±1.0) mV顯著降低至(19.4±1.2) mV。醋酸緩沖液濃度Bc由0.02 mol/L升高至1 mol/L時，CR自(98.2±0.1)%大幅降至(70.6±0.4)%，納米粒粒徑由(202.8±2.2) nm顯著減小(173.7±2.9) nm，表面電位自(32.5±1.2) mV大幅降低至(14.8±0.3) mV，如圖3(d)-(f)所示。

圖3pH值、緩沖液濃度對納米粒粒徑、電位及siRNA復(fù)合率的影響

Fig 3 Influence of pH andBc on particle size, zeta-potential andCR

pH值升高時，殼聚糖氨基質(zhì)子化率降低，而致納米粒表面電位下降(圖3(b))。環(huán)境pH值升高會導致殼聚糖電荷密度降低進而減弱靜電相互作用[25]，使得納米粒結(jié)構(gòu)變得更松散的同時siRNA復(fù)合率亦有所降低。然而在高n(N)/n(P)比條件下，pH值升高對粒徑及siRNA復(fù)合率的影響被高n(N)/n(P)掩蓋，siRNA復(fù)合率及納米粒粒徑保持穩(wěn)定(圖3(a),(c))。Bc增大引起溶液離子強度增大而屏蔽殼聚糖及siRNA所攜帶電荷，靜電作用減弱導致siRNA復(fù)合率大幅降低(圖3(d))，同時殼聚糖分子內(nèi)作用力減弱而致分子剛性增強，納米粒粒徑減小(圖3(e))，測得的表面電位也因滑動層被壓縮而顯著降低[23, 26](圖3(f))。

3結(jié)論

siRNA與陽離子聚合物的復(fù)合作為前述納米粒傳遞過程的基礎(chǔ)，對入胞、轉(zhuǎn)運及siRNA釋放過程皆有極其重要的影響，全面掌握制備條件對CS/siRNA復(fù)合特性的影響具有重要意義。CS/siRNA轉(zhuǎn)染過程中，可以通過n(N)/n(P)比，Mw、DD及pH值、Bc調(diào)控得到siRNA復(fù)合率在90%以上，粒徑100～300 nm，表面電位15～25 mV的納米粒。不同表面性質(zhì)及siRNA復(fù)合率的納米粒將經(jīng)歷不同的入胞、轉(zhuǎn)運路徑及siRNA釋放過程，即可以滿足實際應(yīng)用中的不同要求，從而更高效地將siRNA“轉(zhuǎn)染”并“釋放”于靶細胞的細胞質(zhì)中并獲得理想的基因沉默效果。

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Preparation and property characterization of chitosan/siRNA nanoparticles

ZHANG Demeng1,3, LOU Ruyun1,3,WANG Yu1,3,LIU Xiudong2,YU Weiting1,MA Xiaojun1

(1. Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;2. College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China;3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)

Abstract:With the preparation of Chitosan/siRNA nanoparticles based on electrostatic self-assembly, a nucleic acid dye assay with SYBR? Gold was established to determine the condensation rate (CR) of siRNA in nanoparticles, and then the influence of n(N)/n(P) ratio, Mw, DD, pH and ion strength of chitosan solution on siRNA CR, nanoparticle size and zeta-potential was investigated by SYBR? Gold assay, dynamic light scattering and laser doppler electrophoresis respectively. The results showed that CR rose from (18.6±4.0)% to (92.9±2.0)% as n(N)/n(P) increased from 0.5 to 2 and stayed stable even when n(N)/n(P) reached 150. When n(N)/n(P) was below 2, no stable nanoparticles were detected and the complex was negative charged, while n(N)/n(P) went from 5 to 150, the size of nanoparticles increased from (179.3±5.7) nm to (235.5±8.3) nm and zeta-potential rose from (17.2±1.3) mV to (23.6±0.9) mV. At n(N)/n(P) 150, CR raised with the increase of DD or with the decrease of Bc, the size of nanoparticles increased with the increase of Mw and decreased with the increase of DD or Bc, the zeta-potential of nanoparticles increased with the increase of pH value or DD but decreased with the decrease of Bc. It demonstrated that n(N)/n(P) ratio is the most important factor determining the size, zeta-potential and CR, and nanoparticles with the diameter ranging from 100-300 nm and zeta-potential ranging from 15-25 mV can be easily obtained via adjusting above parameters.

Key words:chitosan; siRNA; nucleic acid dye; condensation rate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.037

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q782

作者簡介：張德蒙(1985-)，男，山東嘉祥人，博士生，師承馬小軍研究員，從事殼聚糖載siRNA納米粒轉(zhuǎn)運和釋放性能研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(20876018)；遼寧省高等學校優(yōu)秀科技人才支持計劃資助項目(LR2013057)；遼寧省“十百千高端人才引進工程”啟動基金資助項目(遼人社[2012]207號)

文章編號：1001-9731(2016)02-02188-05

收到初稿日期：2015-04-24 收到修改稿日期：2015-06-10 通訊作者：劉袖洞，E-mail: liuxd@dicp.ac.cn，于煒婷