謝袁菲，季金茍，向存程，徐　溢

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030)

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納米鍶羥基磷灰石的制備及對(duì)甲氨蝶呤吸附性能的研究*

謝袁菲，季金茍，向存程，徐溢

(重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030)

摘要：為了制備具有較高甲氨蝶呤(MTX)吸附性能的藥物載體用于骨腫瘤治療，用共沉淀法制備不同摻鍶量的納米鍶羥基磷灰石(nano-SrHA)，利用XRD、TEM等對(duì)其進(jìn)行了表征，并考察了共沉淀時(shí)間、摻鍶比、甲氨蝶呤(MTX)濃度、溶液pH值等對(duì)吸附MTX性能的影響。結(jié)果表明，摻鍶比對(duì)nano-SrHA的大小及形狀都有一定影響，隨著摻鍶比的增加，晶體尺寸變?。粨芥J比影響nano-SrHA對(duì)MTX吸收，不同摻鍶比中nano-Sr(0.3)HA對(duì)MTX的吸附效果最佳；共沉淀反應(yīng)時(shí)間增加有利于晶型的銳化和吸附性能的提高；pH值為7.8的弱堿環(huán)境有助于nano-Sr(0.3)HA吸附MTX，最大吸附量高達(dá)43.09 mg/g。nano-Sr(0.3)HA是一種良好的MTX吸附載體。

關(guān)鍵詞：納米鍶羥基磷灰石；吸附性能；甲氨蝶呤

0引言

炎癥、腫瘤等常會(huì)引起骨組織的缺損，不僅造成畸變，還會(huì)引起一系列的功能障礙。納米羥基磷灰石[nano-Ca10(PO4)6(OH)2, nano-HA]是眾多磷酸鈣化合物的一種，其化學(xué)組分和晶型結(jié)構(gòu)類似人體自然骨，表現(xiàn)出較好的生物相容性、生物可降解性、生物穩(wěn)定性、吸附載藥性、引導(dǎo)骨生長、無毒性等生物活性[1-3]。nano-HA因其較大的比表面積和表面活性，能吸附和傳遞蛋白質(zhì)、多肽類、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗等藥物[4]，可有效地提高藥物的通透性而發(fā)揮藥效，故被廣泛地應(yīng)用于骨損傷方面的治療[5-7]。nano-HA中的OH-與2個(gè)Ca2+連接，當(dāng)晶體表面的OH-位置在某一時(shí)刻空缺時(shí)，使得HA晶體表面帶有由Ca2+引起的多余的正電荷而形成較強(qiáng)的吸附位點(diǎn)(C點(diǎn))，這個(gè)位點(diǎn)能夠吸附大分子上的磷酸基團(tuán)或是羧基基團(tuán)[8]。鍶是人體內(nèi)必需微量元素之一，在骨內(nèi)的含量約為0.01%，遠(yuǎn)低于鈣含量。大量實(shí)驗(yàn)表明，納米鍶羥基磷灰石[nano-CaxSry(PO4)6(OH)2, nano-SrHA,x+y=10]比nano-HA具有更好的生物性能，鍶的摻入改變了載體材料的結(jié)晶性和生物降解性，提高骨容量，減少骨流失，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制破骨細(xì)胞活性，增強(qiáng)骨強(qiáng)度和更好地吸附蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸及骨腫瘤治療藥物[9]。

本文以共沉淀法制備了不同摻鍶比的nano-SrHA，并對(duì)其進(jìn)行表征，以含羧基的抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(Methotreaxate, MTX)為模型藥物，考察了nano-SrHA對(duì)MTX的吸附性能，以期找到一個(gè)較好的抗骨腫瘤藥物載體。

1實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

MTX(陜西頂點(diǎn)醫(yī)藥化工有限公司)、硝酸鈣、氯化鍶、磷酸氫二銨、氨水、氫氧化鈉等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

T6-新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限責(zé)任公司)；Shimadzu XRD6000X射線衍射儀(XRD，日本Shimadzu制作所)；HITACHI-600透射電鏡(TEM，日本日立公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市中正儀器制造有限公司)；KQ-2200B超聲清洗器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；FD-1冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)等。

1.2nano-SrHA的制備

采用共沉淀法制備nano-SrHA[10]。在伴有攪拌和回流的三頸瓶中，加入計(jì)量好的硝酸鈣和氯化鍶溶液，用1∶2的氨水調(diào)節(jié)溶液pH值=10，在油浴中加熱至60 ℃。另量取相應(yīng)的磷酸氫二銨溶液，事先用1∶1的氨水調(diào)節(jié)pH值=10，轉(zhuǎn)入滴液漏斗，以每分鐘2～5 mL的速度滴入三頸瓶中。滴加過程中用1∶2的氨水調(diào)節(jié)溶液pH值=10。于80 ℃下反應(yīng)3 h，加熱沸騰1 h，室溫陳化(靜置過夜)，制得nano-SrHAP。過濾，沉淀物用去離子水多次洗滌至pH值=7，沉淀冷凍干燥，制備含不同摻鍶比的nano-SrHA。

1.3nano-SrHA晶型及表面形貌表征

用XRD進(jìn)行晶型分析，掃描2θ角為10～60°；另取少量樣品于 50 mL蒸餾水中，超聲分散后滴到銅網(wǎng)上，用磷鎢酸染色，室溫干燥，再用TEM觀察表面形貌。

1.4檢測波長的選擇

配制一定濃度的MTX溶液，用紫外-可見光200～600 nm掃描，確定MTX最大吸收波長。

1.5MTX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.25 mg/mL的MTX儲(chǔ)備液，分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶中，加0.01 mol/L的NaOH溶液定容，搖勻，即得MTX標(biāo)準(zhǔn)溶液。以0.01 mol/L的NaOH溶液為參比，在MTX最大吸收波長處測定其吸光度，重復(fù)3次，取平均值。

1.6載藥nano-SrHA的制備及藥物吸附量的測定

采用吸附-冷凍干燥法制備載藥nano-SrHA[11]。分別稱取一定量的不同摻鍶比的nano-SrHA粉體于適量藥物濃度的溶液中，超聲30 min，再恒溫振蕩吸附一定時(shí)間，過濾，用去離子水洗滌沉淀，去掉表面粘附的藥物，冷凍干燥沉淀，即得載藥nano-SrHA。濾液稀釋，于MTX最大吸收波長處測定其吸光度，換算成濃度，按下式計(jì)算藥物的吸附量

式中，q表示每克nano-SrHA吸附藥物的量，mg/g；C0為溶液中藥物的初始濃度，μg/mL；CV為吸附后殘留藥物濃度，μg/mL；m為nano-SrHA的質(zhì)量，g；V為吸附液體積，mL。

考察摻鍶比、共沉淀時(shí)間、藥物濃度、溶液pH值對(duì)nano-SrHA吸附MTX性能的影響。

2結(jié)果與討論

2.1摻鍶比對(duì)nano-SrHA晶型的影響

圖1為不同摻鍶比的nano-SrHA XRD圖，從圖中可以看出，2θ在25.8°(002)、31.7°(211)、32.2°(112)分別出現(xiàn)強(qiáng)的特征衍射峰。nano-HA的XRD譜與HA標(biāo)準(zhǔn)卡片(ICSD 09-0432)中的數(shù)據(jù)吻合，nano-HSr的XRD譜與HSr標(biāo)準(zhǔn)卡片(ICSD 33-1348)中的數(shù)據(jù)吻合，其余nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)的XRD譜分別與34-0482、34-0479、34-0478中數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)。由此可以推斷所制備的產(chǎn)物為nano-HA、nano-HSr及nano-SrHA(Sr/[Sr+Ca]=0.3～0.7)。

圖1Nano-HA、不同摻鍶比nano-SrHA、nano-HSr 的XRD圖

Fig 1 XRD patterns of nano-HA, nano-SrHA with different Sr ratios and nano-HSr

從圖1還可以看出，隨著摻鍶比的增加，(002)晶面與(211)晶面衍射峰逐漸向小角度偏移，這和Bragg 公式λ=2dsinθ是相一致的，由于Sr2+半徑大于Ca2+(Sr2+、 Ca2+半徑分別為0.113和0.099 nm)，使得晶格常數(shù)變大、晶面間距d增大，當(dāng)X射線波長λ一定時(shí)，衍射角2θ向小角偏移。

本文發(fā)現(xiàn)，隨著摻鍶比的增加，(211)晶面與(002)晶面峰面積之比隨之增加，R2=0.98914(見表1)。這可以推測，隨著摻鍶比的增加，nano-SrHA沿c軸(002)晶面方向生長趨勢逐漸弱化。

表1(211)晶面與(002)晶面峰面積

Table 1 Peak area of (211) and (002)

Sr/[Sr+Ca]原子比S(002)S(211)S(211)/S(002)0.0334295862.870.34248169433.990.53396190085.600.72425210798.691.020133411816.95

2.2共沉淀時(shí)間對(duì)nano-SrHA晶型的影響

表2為共沉淀時(shí)間對(duì)nano-Sr0.3HA (211)晶面間距和峰高的影響，由表2可以發(fā)現(xiàn)隨著共沉淀時(shí)間的增加，nano-Sr0.3HA (211)晶面間距和峰高逐漸增大。根據(jù)布拉維法則可知，隨著(211)晶面間距d的增大，晶面的結(jié)點(diǎn)密度增大，相鄰晶面間引起減小，晶體成長逐漸變緩，并于3 h后趨于穩(wěn)定。一般認(rèn)為峰高是由同方向排列的晶面分布數(shù)量決定的，(211)晶面峰高隨共沉淀時(shí)間增加而增大，說明其晶面增多，晶體結(jié)晶度提高，且3 h后晶體生長已基本穩(wěn)定。

表2共沉淀時(shí)間對(duì)nano-Sr0.3HA 晶型的影響

Table 2 Effect of coprecipitation time on the crystal forms of nano-Sr0.3HA

Coprecipitationtime/h2θdHeight0.531.4782.83970.671.031.3812.84822.571.531.3412.85183.632.031.3202.85374.102.531.2992.85564.483.031.2822.85714.843.531.2772.85754.984.031.2792.85745.10

2.3摻鍶對(duì)nano-SrHA粒徑的影響

圖2分別為nano-HA(a)、nano-Sr0.3HA(b)和nano-HSr(c)的TEM圖。從圖2可以看出，nano-HA為針條狀，nano-Sr0.3HA為短針狀， nano-HSr為短棒狀，其對(duì)應(yīng)尺寸分別約為?25 nm×130 nm、?20 nm×100 nm和?15 nm×70 nm。這可能和nano-HA沿c軸(002)方向有較強(qiáng)的生長趨勢有關(guān)(見表1)，隨著摻鍶比增加，沿c軸(002)方向生長趨勢減弱，導(dǎo)致晶體尺寸變小。

圖2Nano-HA、nano-Sr0.3HA、nano-HSr的TEM圖

Fig 2 Transmission Electron Microscope of nano-HA, nano-Sr0.3HA, nano-HSr

2.4摻鍶比對(duì)nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖3為摻鍶比對(duì)nano-SrHA吸附性能的影響。

圖3　摻鍶比對(duì)nano-SrHA吸附性能的影響

Fig 3 Ratios of Sr on absorption quantity of nano-SrHA

由圖3可以看出，nano-SrHA對(duì)MTX吸附性能的大小順序?yàn)閚ano-Sr0.3HA>nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA>nano-HSr。nano-SrHA對(duì)MTX的吸附能力可能是由兩方面的原因所決定：(1)不同離子對(duì)MTX的結(jié)合力不同所致，Ca2+離子的半徑小，其對(duì)MTX的結(jié)合力要大于Sr2+對(duì)MTX的結(jié)合力，故nano-HA > nano-HSr；(2)晶格應(yīng)力不同導(dǎo)致其對(duì)MTX的吸收不同，摻Sr2+后的晶體，其晶格應(yīng)力要大于純的nano-HA和nano-HSr，對(duì)MTX的吸附能力增強(qiáng)，故nano-Sr0.3HA> nano-HA。綜合考慮以上兩個(gè)因素，最終導(dǎo)致它們對(duì)MTX吸附的能力為nano-Sr0.3HA> nano-Sr0.5HA>nano-Sr0.7HA>nano-HA >nano-HSr。

2.5共沉淀時(shí)間對(duì)nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖4為制備nano-Sr0.3HA共沉淀時(shí)間對(duì)吸附MTX性能的影響。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，nano-Sr0.3HA吸附MTX的量隨其制備時(shí)的共沉淀時(shí)間的增加而增加，3 h后均基本不變。這可能是因?yàn)樵诠渤恋矸ㄖ苽鋘ano-Sr0.3HA時(shí)，率先形成的缺鈣(或鍶)HA，導(dǎo)致其對(duì)MTX的吸附位點(diǎn)較減少，隨著共沉淀反應(yīng)的時(shí)間增長，正離子的位點(diǎn)逐漸被填補(bǔ)，吸附MTX量也逐漸增加。共沉淀3 h后，nano-CaxSry(PO4)6(OH)2中[x+y]/6基本達(dá)到1.67，形成了較完整的nano-Sr0.3HA晶型，故吸附量不再增加，這和圖3的現(xiàn)象是基本一致的。

圖4　共沉淀時(shí)間對(duì)吸附MTX性能的影響

Fig 4 Effect of coprecipitation time of on the absorption quantity

2.6MTX濃度對(duì)nano-SrHA吸附性能的影響

圖5為溶液pH值=8.8時(shí)， MTX濃度對(duì)nano-Sr0.3HA吸附性能的影響。

圖5　MTX濃度對(duì)nano-Sr0.3HA吸附性能的影響

Fig 5 Effect of MTX concentrations on absorption quantity of nano-Sr0.3HA

由圖5可知，隨著MTX濃度的增加，nano-Sr0.3HA的吸附量隨之增加。當(dāng)MTX為62.40 μg/mL時(shí)吸附量趨于飽和，此時(shí)nano-Sr0.3HA最大吸附量為40.27 mg/g。

2.7pH值對(duì)nano-SrHA吸附MTX性能的影響

圖6為pH值對(duì)nano-Sr0.3HA吸附性能的影響。從圖6可以看出，在pH值=7.8附近的吸附量最大，為43.09 mg/g，過酸或過堿使得吸附量減少。這可能與MTX的pka值及溶液pH值對(duì)nano-Sr0.3HA吸附位點(diǎn)的影響有關(guān)。如圖7所示，MTX上α位的羧基pka=4.7，β位的羧基pka=3.4[12]。在較低pH值環(huán)境中，MTX上的H+解離有限，因此較難被nano-Sr0.3HA吸附位點(diǎn)(Ca2+或Sr2+)吸附；隨著溶液pH值的升高，H+解離增加，從而使MTX呈現(xiàn)負(fù)電荷形式增多，nano-Sr0.3HA對(duì)其吸附增加。然而當(dāng)堿性過強(qiáng)時(shí)，Sr2+、Ca2+所帶來的吸附位點(diǎn)可能會(huì)優(yōu)先吸附富余的OH-，使得nano-Sr0.3HA吸附MTX的能力下降。

圖6　pH值對(duì)nano-Sr0.3HA吸附性能的影響

Fig 6 Effect of pH on the absorption of nano-Sr0.3HA

圖7　甲氨蝶呤結(jié)構(gòu)式

3結(jié)論

(1)Nano-HA呈短針狀，尺寸約?25 nm×130 nm，鍶的摻入抑制了晶體沿c軸方向的生長趨勢，致使其晶體尺寸變小。

(2)隨著共沉淀時(shí)間的增加，nano-SrHA晶型逐漸銳化，對(duì)MTX的吸附量隨之增加，3 h后基本不變。

(3)由于Sr的摻入，晶體應(yīng)力發(fā)生改變，nano-SrHA對(duì)MTX的吸附不僅與鈣離子相對(duì)量有關(guān)，也與應(yīng)力有關(guān)，最終導(dǎo)致nano-Sr0.3HA對(duì)MTX的吸附效果最佳。

(4)弱堿環(huán)境有助于提高nano-SrHA吸附MTX性能，當(dāng)pH值為7.8時(shí)，nano-Sr0.3HA對(duì)MTX吸附可達(dá)到43.09 mg/g。

綜上所述，nano-Sr0.3HA對(duì)含羧基抗腫瘤藥物具有良好的吸附性能，有望成為骨腫瘤治療的良好的藥物載體。

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Preparation and absorption capability study of strontium substituted nano-hydroxyapatite for methotreaxate

XIE Yuanfei，JI Jingou，XIANG Cuncheng，XU Yi

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China)

Abstract:Strontium substituted nano-hydroxyapatite (nano-SrHA) was synthesized by co-precipitation method and applied to treat bone tumors.. The morphology of nano-SrHA was determined by transmission electron microscope (TEM) while its phase composition was characterized with X-ray diffraction (XRD). The absorption capability of nano-SrHA effected by coprecipitation time, feeding ratios of Sr, methotreaxate (MTX) concentrations and pH were also investigated. The results showed that the diffraction angles of nano-SrHA shifted to small value with the increase of feeding ratios of Sr, crystal forms and absorption capability increased with the coprecipitation time, and the nano-Sr(0.3)HA with the acicular structure had the best absorption capability of 43.09 mg/g when the pH was about 7.8. It indicated that nano-Sr(0.3)HA might be a potential candidate as MTX-delivery carrier.

Key words:nano-SrHA;absorption capability;methotreaxate

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.007

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：O614.23+2; R318.08

作者簡介：謝袁菲(1989-)，女，重慶人，在讀碩士，師承季金茍教授，從事納米材料研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21375156)

文章編號(hào)：1001-9731(2016)02-02031-05

收到初稿日期：2015-03-10 收到修改稿日期：2015-10-21 通訊作者：季金茍，E-mail: 725_tiger@sina.com