王維生，李桂芹，白 琳，李明偉，肖 靜，李真玉，馬志強(qiáng)，趙 敏

（山東壽光市人民醫(yī)院，山東 壽光 262700）

檢測阿爾茨海默病患者血漿腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶活性的方法研究

王維生，李桂芹，白 琳，李明偉，肖 靜，李真玉，馬志強(qiáng)，趙 敏

（山東壽光市人民醫(yī)院，山東 壽光 262700）

目的 分析阿爾茨海默癥病患者血漿中腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶活性的方式。方法 分析經(jīng)臨床診斷為阿爾茨海默癥病患者血液1 mL，經(jīng)過抗凝處理之后，在離心作用下獲取血漿。分別取出2.5 μL，5 μL，7.5 μL和10 μL血漿并放置于96孔板中，從而在加入定量反應(yīng)液與酶底物后，采用熒光酶標(biāo)儀觀察血漿內(nèi)部的TACE在37℃下與底物酶反映的速度。結(jié)果 通過對比7.5 μL的血漿反應(yīng)體系及其他反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)TACE的酶反映速度最快。結(jié)論 檢測阿爾茨海默病患者血漿內(nèi)部的TACE活性最適宜的血漿劑量是7.5 μL。

腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶；阿爾茨海默??；酶反應(yīng)速度

老年癡呆癥屬于一種大腦器質(zhì)性損害造成的腦部功能障礙，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，在老年癡呆病人中發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)有明顯炎癥與自主免疫反應(yīng)[1]，腫瘤壞死因子屬于一種重要的細(xì)胞因子，主要參與免疫及炎性反應(yīng)，通過細(xì)胞膜上的受體發(fā)揮出實際作用[2]，TNFR經(jīng)TACE酶切后，會釋放可溶性的TNFR（sTNFR）[3]。在AD中，TACE可以作為臨床上診斷AD的一個生物學(xué)指標(biāo)。在本實驗中，選用了不同劑量的血漿參與酶底物反應(yīng)，從而獲取到相關(guān)曲線圖，根據(jù)每一條曲線相同時間段內(nèi)的斜率，證實酶反應(yīng)速度，經(jīng)過對比分析，檢測出AD患者血漿中的TACE活性的提供最佳血漿劑量。

1 材料與方法

1.1 血漿收集

在清晨，需要保持空腹的狀態(tài)，并且進(jìn)行靜脈穿刺抽取靜脈血并放置于EDTA的抗凝管內(nèi)部，從而適當(dāng)?shù)奶砑拥鞍酌敢种苿?，在離心之后，吸取上層血并置于EP管內(nèi)部，保存在-80℃，盡量避免出現(xiàn)反復(fù)凍融的情況。

1.2 實驗試劑

酶底物：R&D system公司產(chǎn)品。Tris-HCL：索萊寶公司產(chǎn)品。氯化鋅：天津恒興化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）：中昊生物公司產(chǎn)品。AEBSF：Roche公司產(chǎn)品。

1.3 實驗儀器

酶標(biāo)儀（SpectraMax M5）：香港分子儀器有限公司，中國。

1.4 反應(yīng)原理及檢測步驟

分別取87.5、85、82.5、80 μL的血漿稀釋液，放置于96孔板中。針對每一個孔分別加入2.5、5、7.5、10 μL的AD血漿。保證在避光狀態(tài)下，每個孔都需要加入10 μL的酶底物，輕輕混勻，立即檢測。將酶標(biāo)儀調(diào)至37℃，在320 nm的激發(fā)波長、405 nm的發(fā)射波長處測定TACE與底物的反應(yīng)速度，分別得到四條酶反應(yīng)曲線。在這四條曲線上從同一起點分別取七個數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析（One-Way ANOVA）并繼以Turkey法進(jìn)行，以““表示計量資料，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

檢測血漿中TACE活性的最佳血漿劑量，分別加入不同劑量血漿的酶反應(yīng)體系之間相比，加入7.5 μL血漿的酶反應(yīng)曲線斜率最大，與2.5，5.0，10 μL的酶反應(yīng)曲線斜率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

3 討 論

在AD中，TACE是參與其病理過程的，TACE能夠酶切TNFR，并且釋放出可溶性TNFR，當(dāng)TACE的活性較強(qiáng)時，應(yīng)該適當(dāng)?shù)淖尲?xì)胞表達(dá)出TNFRI和TNFRII降低，TNFRI表達(dá)降低，會導(dǎo)致Aβ的生成量降低；而TNFRII表達(dá)降低，卻會導(dǎo)致Aβ的生成量增多。

表1 檢測血漿中TACE活性的最佳血漿劑量（，μL）

表1 檢測血漿中TACE活性的最佳血漿劑量（，μL）

組別2.557.510斜率7275.88±800.899*12927.7±1373.877*30166.5±1840.2616048.5±2000.491*

圖1

在本實驗中，我們將AD患者的血漿與酶底物加在一起，在37℃，激發(fā)波長320 nm，發(fā)射波長405 nm的狀態(tài)下，經(jīng)過分析酶反映曲線，能夠發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入7.5 μL血漿的時候，酶反映曲線的斜率最大，此時速度也最快。綜上所述，臨床上檢測AD血漿中TACE活性的最佳血漿劑量是7.5 μL。

[1] Wyss-Coray T,Mucke L.Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword[J].Neuron,2002,35(3):419-432.

[2] Wajant H,Pfizenmaier K,Scheurich P.Tumor necrosis factor signaling[J].Cell Death Differ,2003,10(1),45-65.

[3] Reddy P,Slack JL,Davis R,et al.Functional analysis of the domain structure of tumor necrosis factor-alpha converting enzyme[J].J Biol Chem,2000,275(19):14608-14614.

[4] 馬貴亮,毛偉征,楊 堃,安 崗,岱震波.人TNF-α重組慢病毒載體構(gòu)建及其臍血間質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,3(1):189-192,195.

本文編輯：吳宏艷

R592

B

ISSN.2095-6681.2016.30.079.02