王楠 周鳳書

摘 要 采用超聲波輔助乙醇提取橙皮中黃酮類化合物，以硝酸鋁顯色法測定的黃酮類化合物總量為指標，探究平遠慈橙皮黃酮類化合物的提取工藝。運用單因素實驗研究溶劑pH、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比對黃酮類化合物提取率的影響，通過正交試驗進一步優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明：平遠慈橙皮黃酮類化合物最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)50%，溫度50 ℃，料液比1∶50，超聲時間50 min。通過最佳工藝驗證，此條件下平遠慈橙皮黃酮類化合物提取率達到2.10%。該工藝簡單可行，有較好的參考價值。

關(guān)鍵詞 慈橙皮；黃酮類化合物；超聲波；提取

中圖分類號：TQ461 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）12--04

平遠慈橙產(chǎn)于梅州市平遠縣，目前該縣已有慈橙種植面積達6 667 hm2，掛果面積2 000 hm2，總產(chǎn)約2.6萬t，是廣東省最大的臍橙生產(chǎn)基地[1]。平遠慈橙經(jīng)檢測，其中維生素C、維生素E、鐵、鋅、鎂等5個指標遠高于其他類臍橙，富含β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、果膠以及黃酮類化合物等，享有“橙中之王”的美稱。

黃酮類化合物（Flavonoids）又名生物類黃酮化合物（Bioflavoinoids），是植物在長期自然選擇過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物，是許多中草藥的有效成分。近年來，許多研究表明，黃酮類化合物具有消炎抗菌、清熱解毒、鎮(zhèn)靜和利尿等作用，是活性氧的良好清除劑，尤其是抗自由基和抗癌防癌的作用[2-3]，使對黃酮類化合物的研究進入了一個新階段。黃酮類化合物安全、無毒，在醫(yī)藥、食品加工等方面已被廣泛應(yīng)用[4]。橘類黃酮具有的消炎抗過敏性使其在日用化工領(lǐng)域的應(yīng)用前景日益廣闊。據(jù)報道，國外已經(jīng)把柑橘類黃酮添加在牙膏中用于治療過敏性牙齦炎，效果較好。國外正在研究以類黃酮代替咖啡因和奎寧的新工藝，而在我國，把柑橘類黃酮作為食品添加劑的應(yīng)用研究工作幾乎為空白。我國擁有豐富的柑橘資源，深度開發(fā)柑橘類黃酮資源，尤其是在醫(yī)藥、食品和保健品領(lǐng)域中的應(yīng)用，具有重大的經(jīng)濟效益和社會效益。

近年來，平遠縣以打造“慈心農(nóng)業(yè)”為出發(fā)點，依托農(nóng)業(yè)龍頭企業(yè)延伸慈橙產(chǎn)業(yè)鏈、濃縮汁、橙肉、香精油和百分百鮮果汁等深加工產(chǎn)品不斷面世，取得了巨大的經(jīng)濟效益[5]。同時，每年因慈橙深加工而產(chǎn)生大量的橙皮并未得到充分利用，造成了資源浪費。橙皮中含有大量有益的天然化合物，黃酮類化合物就是最重要的一類。當前，雖然柑橘類黃酮化合物的研究工作已取得一定進展，但還需解決一些現(xiàn)實問題。如尚缺少適合工業(yè)化生產(chǎn)的提取工藝參數(shù)；缺少快速、高效、簡單的檢測分析方法；對柑橘類黃酮化合物某些生理功能及其作用機理研究不深入等。

目前，提取黃酮類化合物的方法很多，如水浸提取法、索氏提取法、有機溶劑法等[6]。本研究采用超聲波輔助法從慈橙皮中提取黃酮類化合物，研究乙醇溶液體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比對黃酮類化合物提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化提取條件，為柑橘類果皮的有效利用及黃酮類化合物的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

平遠慈橙，采自廣東省梅州市平原縣農(nóng)業(yè)科技示范基地。蘆丁標準品（純度98%）中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和預處理

采集新鮮慈橙剝下外皮，洗凈后切成小塊，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過40目篩子，于磨口瓶中密封干燥貯存。

1.2.2 黃酮類化合物標準曲線的繪制

精確稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標準品0.020 g，乙醇溶解，制成0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。取標準液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，依次編號；各加入1.4 mL的5%亞硝酸鈉搖勻，靜置5 min；再加入1.4 mL的10%硝酸鋁搖勻，靜置5 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL ，搖勻顯色，最后用乙醇定容至刻度。波長510 nm處測定吸光度。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制標準曲線，得出線性回歸方程。

1.2.3 黃酮類化合物提取工藝流程

工藝流程：慈橙皮-預處理-超聲波輔助提取-抽濾-酸化沉淀-過濾取沉淀物-干燥得粗黃酮類化合物。

1.2.4 優(yōu)化平遠慈橙中黃酮類化合物的純化工藝

以乙醇為提取劑，采用超聲波法提取黃酮類化合物，考察pH值對黃酮類化合物提取率的影響。各稱取樣品于7個錐形瓶，分別加入pH值4、5、6、7、8、9、10、11的50%乙醇水溶液。50 ℃下超聲輔助提取60 min。僅不加原料試劑作為空白對照液，計算pH值對黃酮類化合物提取率的影響。

1.2.5 單因素實驗優(yōu)化平遠慈橙中黃酮類化合物的提取工藝

根據(jù)標準曲線分別研究乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比（原料質(zhì)量∶溶劑體積，g/mL）、提取時間對黃酮類化合物提取率的影響，僅不加原料試劑作為空白對照。

乙醇體積分數(shù)單因素試驗：樣品分別加入30%、40%、50%、60%、70%乙醇水溶液。溫度50 ℃，超聲波輔助循環(huán)提取60 min，計算乙醇濃度對黃酮類化合物提取率的影響。

溫度單因素試驗：樣品加入濃度50%乙醇水溶液100 mL，分別在30、40、50、60、70 ℃溫度下超聲波輔助提取60 min，計算提取溫度對黃酮類化合物提取率的影響。

超聲時間單因素試驗：樣品用濃度50%乙醇水溶液溶解，料液比1∶50，溫度50 ℃，超聲輔助提取20、30、40、50、60min，計算提取時間對黃酮類化合物的提取率的影響。

料液比單因素試驗：樣品按料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70，在50 ℃下超聲輔助取60 min，計算醇溶劑與橙皮質(zhì)量比對黃酮類化合物提取率的影響。

在波長510 nm處測定吸光度。按照吸光度-濃度標準曲線計算黃酮類化合物提取率。

提取液中黃銅類化合物得率（%）

式（1）中：V0為第一次定容后提取液的體積（mL）；V1為從母液中量取的提取液體積（mL）；V2為第二次定容后提取液的體積（mL）；C為提取液中總黃酮濃度（μg/mL）；M為稱取橙皮質(zhì)量（g）。

1.2.6 正交試驗

為系統(tǒng)考察超聲波輔助溶劑萃取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選用L9（34）正交試驗，以測得的樣品中總黃酮含量為考察指標，考察乙醇濃度%（A）、超聲溫度℃（B）、料液比（C）和超聲時間min（D）對黃酮類化合物的提取率的影響[7]。正交試驗因素與水平見表1。

1.2.7 最佳工藝驗證實驗

稱取2.00 g橙皮樣品5份，調(diào)節(jié)溶劑pH為10，在優(yōu)選工藝條件下乙醇濃度為50%，溫度50 ℃，料液比1∶50，超聲時間50 min進行提取，按照黃酮類化合物的測定及得率的計算方法計算提取率及相對標準偏差[7]。

1.2.8 加標回收率實驗

稱取2.00 g橙皮樣品5份，然后各加入含0.2 mg的蘆丁標準溶液，在最佳提取工藝條件下進行提取實驗，測量吸光度，并按下式計算加標回收率：

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類化合物標準曲線

按1.2.2方法進行實驗，將實驗結(jié)果進行線性回歸，實驗結(jié)果見圖1。得回歸方程為C= 86.998A + 0.3881，R? = 0.9982說明在吸光度0.018～0.217，該方程的線性擬合程度較好。

2.2 平遠慈橙黃酮類化合物的純化工藝優(yōu)化

黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在堿性和中性條件下溶解度明顯增大，而在酸性條件中則沉淀析出。隨著溶液pH值的增加，溶解度增大，當pH10左右，提取率達到最大。見圖2。

2.3 單因素試驗對黃酮類化合物提取率的影響

2.3.1 乙醇濃度對黃酮類化合物的提取率的影響（見圖3）

2.3.2 提取溫度對黃酮類化合物的提取率的影響（見圖4）

2.3.3 提取時間對黃酮類化合物的提取率的影響（見圖5）

2.3.4 料液比對黃酮類化合物的提取率的影響（見圖6）

上述單因素試驗結(jié)果表明：最佳提取條件為乙醇濃度50%，溫度50 ℃，料液比1∶50，超聲時間50 min。

2.4 正交試驗優(yōu)選慈橙皮黃酮類化合物提取工藝

按極差R大小排列因素主次。由表可知，極差值反映的因子影響順序：C（料液比）>B（溫度）>A（乙醇濃度）>D（超聲時間）。由正交實驗得出最優(yōu)水平實驗方案為A2B1C3D3即乙醇濃度為50%，溫度為50 ℃，料液比1∶50，超聲時間70 min作為最佳工藝[8]。但由于提取時間對提取率的影響最小，且遠遠小于其他因素。故最佳實驗方案為A2B1C3D1。

2.5 最佳工藝驗證實驗結(jié)果（見表3）

劉蓉、周正勇、羅南芳[9]等用超聲波法提取塔羅科血橙皮黃酮類化合物，提取率為1.0213%。本實驗進行各因素優(yōu)化，按上述最佳工藝條件進行驗證實驗，通過檢測計算得出平均提取率為2.10%，相對標準偏差RSD（Relative Standard Deviation）為0.58%。表明提取黃酮類化合物工藝穩(wěn)定性好，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。

2.6 加標回收率實驗結(jié)果（見表4）

通過計算得出加標回收率平均值97.47%，RSD為1.31%（n=5），表明以蘆丁為對照，經(jīng)紫外分光光度法測定黃酮質(zhì)量濃度的黃酮回收率高，說明本次實驗所測數(shù)據(jù)準確、可靠。

3 結(jié)論

本實驗采用超聲波輔助溶劑法提取平遠慈橙皮中黃酮類化合物，用硝酸鋁顯色法測定黃酮類化合物提取率。采用單因素實驗驗證，正交試驗優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明：平遠慈橙皮中黃酮類化合物最佳提取工藝為乙醇濃度50%，溫度50 ℃，料液比1∶50，超聲時間50 min。通過最佳工藝驗證，在此條件下平遠慈橙皮中黃酮類化合物提取率為2.10%。

在優(yōu)選的提取工藝條件下，驗證實驗RSD為0.58%。加標回收率實驗RSD為1.31%、加標回收率平均值為97.47%。該工藝操作簡便、成本低、收率高，具有良好的穩(wěn)定性和重復性，可為平遠慈橙皮黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

參考文獻

[1]劉碧林.平遠慈橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景[J].現(xiàn)代園藝，2012（11）.

[2]王光鳳，王小晨，肖璘，等.柑橘黃酮川陳皮素的抗腫瘤作用研究[J].中草藥，2007，38（11）.

[3]Li R，Li J，Hu C M，et al.Therapeutic Effect of Hesperidin on Adjuvant Arthritis in Rats and its Mechanisms[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2008，24（4）.

[4]張勝幫，趙玲玲.黃酮類化合物的提取純化研究進展[J].溫州大學學報：自然科學版，2007（5）.

[5]侯慧妮，羅娟娟，朱雙玲.平遠慈橙衍生“甜心產(chǎn)業(yè)”[N].梅州日報.2013-01-21（001）.

[6]董宇.黃酮類化合物的提取方法研究及展望[J].人參研究，2009（4）.

[7]田春蓮，蔣鳳開.茜草總黃酮提取工藝研究[J].食品科學，2011（24）.

[8]樊瑞勝，陳平，劉巖，等.桔皮類黃酮乙醇提取工藝研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報：自然科學版，2006（4）.

[9]劉蓉，周正勇，羅南芳，等.超聲波法提取塔羅科血橙皮黃酮類化合物工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013（17）.

（責任編輯：劉昀）