馬云超　馬珊珊　徐珊珊　丁孝營(yíng)　宋冰

傳統(tǒng)上喜樹堿提取多采用70～90%乙醇滲漉，耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣。另有文獻(xiàn)報(bào)道超聲波和超臨界流體等現(xiàn)代技術(shù)提取喜樹堿，與常規(guī)溶劑提取法相比，其提取效率高，操作簡(jiǎn)便，但一次性投入成本高。本研究以甲醇為提取溶劑，利用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了喜樹堿回流法提取工藝。

儀器與材料

高效液相色譜系統(tǒng)：LC-6A，日本島津公司；電子分析天平：AUY220型，日本島津公司；恒溫水浴鍋：DK-S14型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱：DGG-9240B型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

所用甲醇為分析純；蒸餾水及超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品純度為95.8%；喜樹葉樣品采自浙江桐廬浙江林學(xué)院培植基地四年生喜樹，葉子用自來(lái)水洗凈，室溫下陰干，粉碎后保存于干燥器中。

實(shí)驗(yàn)方法

喜樹堿含量的HPLC分析方法。色譜條件：色譜柱SinoChrom ODS-BP（4.6mm×250mm，ID 5um）：檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流動(dòng)相為乙腈/水（40：60，v/v）。

準(zhǔn)確稱取喜樹葉干粉20g，置于500mL圓底燒瓶中，在設(shè)計(jì)條件下進(jìn)行提取，提取液經(jīng)鋪有硅藻土的布氏漏斗抽濾，合并濾液，37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去甲醇，用氯仿+5%甲醇等體積萃取濃縮液3次，濃縮回收氯仿，加入甲醇/氯仿（1/1，v/v）溶解濃縮物，定容]00m L，HPLC測(cè)定提取液中喜樹堿的濃度。線性回歸方程：Y=19656X+607.15，r=0.9986，線性范圍：3.55～71μg·mL^-1。

喜樹葉回流法提取工正交實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇甲醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素，以喜樹堿的提取率為考察指標(biāo)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件建立L₁₆（45）正交試驗(yàn)表（見表]）并進(jìn)行方差分析。

結(jié)果與分析

正交結(jié)果與方差分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表2及表3。

比較表2的R_（極差），各因素極差大小為：R_A>R_D>R_B>R_C，優(yōu)先順序?yàn)锳>D>B>C，最優(yōu)工藝為：A₁B₂C₄D₃，即甲醇濃度為65%，提取時(shí)間1h，料液比為1：16，提取溫度為70℃。

從節(jié)約成本及環(huán)保角度考慮，優(yōu)化工藝條件為：A₁B₂C₂D₃，即甲醇濃度為65%，提取時(shí)間1h，料液比為1：10，提取溫度為70℃。在該工藝條件下平行提取5次，喜樹堿提取率為0.490±0.004‰，結(jié)果表明優(yōu)化條件下工藝穩(wěn)定性較好。

該研究利用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行多因素分析，優(yōu)化了喜樹堿的甲醇回流法提取工藝，明確了最佳工藝條件：甲醇濃度為65%，提取時(shí)間1h，料液比為1：10，提取溫度為70℃，該工藝條件下，喜樹堿的提取方法簡(jiǎn)便、提取率穩(wěn)定，為喜樹堿的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。