李強 任立凱 陳鳳 孫中偉 王康君 郭明明

摘要：為了探尋新的育種手段，解決目前小麥常規(guī)育種中普遍存在的種質(zhì)資源匱乏問題以提升育種效率，開展了小麥N離子束注入誘變育種與常規(guī)育種相結(jié)合的應(yīng)用研究。以N離子不同劑量注入小麥品種連麥6號籽粒進行誘變處理，經(jīng)過M1代損傷效應(yīng)分析，M2代突變體的分類統(tǒng)計和篩選，M3代常規(guī)系譜法穩(wěn)定性鑒定，考察了N離子注入對連麥6號農(nóng)藝性狀的誘變效應(yīng)。結(jié)果表明：N離子注入對連麥6號的誘變效應(yīng)在M1代顯著地表現(xiàn)在株高、結(jié)實率、抽穗期和成株率上，M2代的突變率隨N離子注入劑量的增加而提高，由低到高3種劑量處理的突變率分別為5.38%、8.98%和11.02%，篩選出的3個超親變異性狀（矮稈多蘗、早熟性、大穗）在M3代因不同的劑量處理其重復穩(wěn)定性存在明顯差異；試驗明確了不同劑量的離子注入處理對小麥生理性狀影響的變異效應(yīng)不同。

關(guān)鍵詞：小麥；N離子束；誘變育種

中圖分類號：S512.103.52文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0018-05

黃淮麥區(qū)是我國小麥的主產(chǎn)區(qū)，多年的常規(guī)雜交育種致使小麥育種的遺傳背景變得單一，品種的同質(zhì)化現(xiàn)象嚴重。實踐中，借助遠緣雜交來打破此瓶頸，又遇屬間不育性障礙且很難突破。誘變育種技術(shù)在種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良上具有獨特作用，它可以誘發(fā)基因突變，打破基因連鎖，在相對較短的世代周期內(nèi)獲得常規(guī)育種方法難以獲得的新類型、新性狀、新基因，可以豐富育種材料的遺傳背景。在眾多誘變手段中離子束的誘變作為后起之秀倍受關(guān)注。這不僅是因為離子束生物工程的應(yīng)用發(fā)端于我國[1，2]，更是因為它不象其它輻射誘變只限于能量作用引起 DNA鏈斷裂，更有其能量、質(zhì)量、電荷的三因子協(xié)同作用產(chǎn)生的生物分子原子移位、重組和化合的優(yōu)勢[3]，具有損傷輕、存活率高、突變率高和突變譜廣、重復性好等特點[4～6]。

目前離子束誘變育種研究正在國內(nèi)外蓬勃展開，涉及方面從突變體庫的選擇構(gòu)建、品性改良、種質(zhì)創(chuàng)新和離子束介導轉(zhuǎn)基因[7～12]到以優(yōu)化離子束誘變效應(yīng)的誘變離子、劑量、時間及不同誘變靶標材料的對應(yīng)選擇方面[13～17]。從前人的這些研究成果看，離子束誘變邊際效應(yīng)最大化的受制因素往往與靶標材料密切相關(guān)。因此要獲得好的誘變效率，誘變源的參數(shù)最佳組合必須以誘變材料為轉(zhuǎn)移，不能教條地套用。為了提高處理后代的突變頻率和突變類型，通常誘變育種選用對本地區(qū)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性好、綜合性狀優(yōu)良、遺傳背景豐富且某些性狀尚存在改良余地的品種為主。本院自育品種連麥6號從親本遺傳背景和生產(chǎn)生態(tài)適應(yīng)性看大致符合這些條件，為此我們選擇該品種開展了小麥N離子束注入誘變育種應(yīng)用研究，試圖找到一套適合本地品種和生態(tài)條件的與常規(guī)育種相得益彰互為補充的育種方法。

1材料與方法

1.1供試材料

供試小麥品種連麥6號為本院自產(chǎn)。

1.2輻照處理

離子注入委托中囯科學院合肥物質(zhì)科學研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所完成。注入離子為N離子，能量為30 keV，束流大小為10 mA，真空度為10-2～10-3 Pa，注入劑量分別為2×1017 、4×1017、6×1017 N+/cm2。每個離子注入劑量處理均為1 000粒干種子。

1.3田間試驗方法

試驗在連云港市農(nóng)業(yè)科學院玉帶河試驗場進行。2012年11月5日播種M1代，行距 22.5 cm，株距2 cm，每小區(qū)播種500粒，重復2次。苗期每小區(qū)定點調(diào)查田間發(fā)芽勢、發(fā)芽率和成活率，考察不同劑量處理對連麥6號種子的損傷情況，同時單株掛牌跟蹤調(diào)查生育期。收獲前每小區(qū)隨機取樣20株室內(nèi)考種。M1代成熟時不做選擇，按處理單收主莖穗。

2013年10月15日對上年收獲的單株主莖穗按不同誘變處理單株單行種植M2代，每單株行長1 m， 每隔10行種1行野生型連麥6號為對照，以便于對比觀察。調(diào)查各處理M2代群體的生育期、株高、分蘗、穗長等農(nóng)藝性狀，觀察記載其它性狀（株、粒、葉的形狀、顏色等）變異，以超野生型連麥6號（CK）不同數(shù)量性狀平均值3倍標準差之外的個體作為突變株，統(tǒng)計各處理不同類型的突變率，同時按處理根據(jù)小麥不同生育進程有所側(cè)重地分莖稈、熟性、穗部三大類變異性狀進行株選淘汰，保留性狀向優(yōu)突變的變異株。

2014年10月20日再對中選的變異株M2代按不同的離子注入劑量處理依常規(guī)育種系譜法建立株系譜，針對所篩選的變異性狀田間觀察和室內(nèi)考種對M3代每個株系進行穩(wěn)定性重復鑒定，選擇性狀向優(yōu)突變且遺傳特性相對穩(wěn)定的材料。

2結(jié)果與分析

2.1N離子束不同注入劑量對連麥6號M1代的影響

考慮傳統(tǒng)的物理誘變的遺傳通常表現(xiàn)為一代平、二代突、三代穩(wěn)的特點，所以在種植M1代時特意采用了晚播密植的方法，以盡可能降低分蘗數(shù)，利于集中突顯M1代主莖的誘變表達。從表1中可以看出，N離子的注入對連麥6號的損傷很明顯，M1代不僅出現(xiàn)了發(fā)芽勢弱的情況，而且發(fā)芽率和存活率亦出現(xiàn)雙低現(xiàn)象，三項指標與CK的差異幾乎均達顯著或極顯著水平。從存活率指標看，3個N離子注入劑量處理的存活率2個超過57%，1個接近50%，說明選擇2×1017～6×1017 N+/cm2這個注入誘變劑量范圍對連麥6號是適宜的。從田間對比觀察看到，M1代也出現(xiàn)了一些諸如葉寬色黃、抽穗不一、穗子畸形、高矮不齊等現(xiàn)象，這顯然也是離子注入致?lián)p的表現(xiàn)。

為了更科學地作出評估判斷，進一步對大量的室內(nèi)考種數(shù)據(jù)和田間觀察數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，凡經(jīng)N離子注入處理的株高、結(jié)實率、抽穗期、成株率與CK差異達極顯著或顯著水平，而其它三項穗部性狀表現(xiàn)差異不顯著。再從不同劑量處理間的比較看，除了成株率的差異達顯著外，其余的性狀指標均不顯著。 由此表明與其它的誘變源相比較，N離子束的誘變效果在M1代就得到突現(xiàn)，而且這種表現(xiàn)是隨注入劑量增加而增大。但考慮M1代植株在遺傳上一般為復雜的突變嵌合體，其損傷效應(yīng)出現(xiàn)的變異一般不能傳遞給后代，所以只收主莖穗而不作選擇。

2.2N離子束不同注入劑量處理連麥6號M2代的變異表現(xiàn)

3個離子注入劑量處理由低到高分別收獲了593、486、395個主莖穗。M2代是誘變育種選擇的關(guān)鍵世代，為便于觀察甄別M2代的變異分離，對M1代主莖穗沒有混收混種，而是嚴格按不同N離子注入劑量處理建立起同源穗行種植圃。田間觀察，連麥6號M2代的變異分化非常豐富，不同劑量處理的1 474個穗行的15 857個單株中共有1 244 株出現(xiàn)一到多個性狀的突變，總表型突變率達7.85%。由表3可以看出，連麥6號M2代的突變率隨N離子注入劑量的增加而提高，由低到高 3種劑量處理的突變率分別為5.38%、8.98%和11.02%，多重比較差異顯著。這種趨勢顯然也與M1代的損傷效應(yīng)相吻合。細分變異類型的差異還發(fā)現(xiàn)，突變?nèi)后w中以莖稈的突變頻率最高，其次為葉片、育性和熟性的變異，而穗部性狀的突變頻率相對較低。進一步縱向比較處理間的突變差異，高劑量的穗部、莖稈和熟性突變率顯著高于中低劑量的突變，中劑量的葉片突變又顯著高于高劑量的突變。這表明對不同性狀的選擇存在著一個與之對應(yīng)的最佳注入誘變劑量。綜觀1 244個M2代變異株，負向弱親變異的有1 126株，占比高達90.5%，正向超親變異的占比很低，而且還多是正負變異性狀混搭株，僅占9.5%。

2.3N離子束不同注入劑量處理的連麥6號M3代的穩(wěn)定性表現(xiàn)

按矮稈多蘗、早熟性、大穗三種突變類型從M2后代中選出相符的變異突變株57株，其中涉及莖稈性狀的24株、穗部性狀的18株、熟性的15株。按M2的種植方法建立株系圃，分別考量鑒定熟性、莖稈和穗部性狀變異的遺傳穩(wěn)定性。由表4可見，選出的3個超親變異性狀在不同劑量處理M3代上表現(xiàn)的重復穩(wěn)定性存在明顯差異。不同處理早熟性變異株抽穗期比CK提前1～3天，中低劑量處理的差異顯著；矮稈變異性狀穩(wěn)定性突出，3個劑量處理的平均株高分別比CK矮14.0、8.5 cm和11.7 cm，差異達顯著或極顯著水平；分蘗變異性狀，低劑量處理的統(tǒng)計差異顯著，單株平均分蘗比CK增2.6個，另兩個處理雖也表現(xiàn)增加，但不顯著；穗部變異性狀的穩(wěn)定性主要測定了主莖穗的粒數(shù)、穗長和粒重3個指標，從不同劑量處理的大穗突變株與之對應(yīng)的測定數(shù)據(jù)看，中高劑量處理的大穗突變株的大穗特性得到保持，3個測定指標都顯著高于CK。綜上可見，從M2代篩選的3個超親突變性狀都基本得到保持，但各性狀尚存在較大的變幅，說明這些性狀在M3代的穩(wěn)定性還不夠，還須進一步作世代穩(wěn)定性篩選。

3討論與結(jié)論

試驗完整觀察統(tǒng)計分析了N離子束不同劑量處理的連麥6號3個世代的農(nóng)藝性狀表型變異情況，可以看出，3種劑量的N離子束注入對連麥6號田間出苗的損傷隨注入劑量的增加而加劇，但并未呈現(xiàn)“馬鞍形”的存活率劑量效應(yīng)曲線[18]。這恰恰反映出不同小麥品種由于基因型的差異對注入離子劑量的耐受力和敏感性的差異。統(tǒng)計分析表明低能N離子束注入對連麥6號多項生物學指標產(chǎn)生的影響在M1代就有顯著的表現(xiàn)。這與以往認為誘變處理產(chǎn)生的M1代突變大多為隱性突變的現(xiàn)象有較大的出入，這種差異可能與注入的有生物活性的N離子與生物分子作用很強有關(guān)。但為避免M1代可能出現(xiàn)的突變嵌合體的干撓導致變異的丟失，所以收獲時未對其進行選擇。

試驗再次證明，M2代是誘變分離最大、出現(xiàn)變異類型最多的一個世代，3個劑量處理的總突變率為7.85%。就連麥6號而言，突變率是隨N離子注入劑量的增加而提高，試驗設(shè)定條件下2×1017～6×1017 N+/cm2的劑量范圍內(nèi)M1代的損傷程度愈重M2代的突變率愈高?？傮w上看突變?nèi)后w中以莖稈的突變頻率最高，其次為葉片、育性和熟性的變異，而穗部性狀的突變頻率相對較低。6×1017 N+/cm2注入劑量的誘變效率最好，其總突變率達11.02%，細分的莖稈、熟性以及穗部性狀的突變率都顯著高于其它劑量處理。值得注意的是：獲得的1 244個M2代變異株中負向弱親變異占絕對多數(shù)，正向超親變異的早熟、矮稈、優(yōu)良株型等表形突變以及穗粒數(shù)、粒重等微突變的占比相對較低，可供育種選擇的正向超親變異或混合型變異株僅有9.5%。但本試驗中不同劑量間表現(xiàn)出的誘變差異還是給我們留下了對離子束誘變小麥性狀變異可調(diào)控的努力空間。

比較同源株系圃間的性狀穩(wěn)定性差異，一些超親的變異性狀在M3代上得到保持。2×1017 N+/cm2處理的矮稈多蘗突變性狀保持更好，而4×1017 N+/cm2和6×1017 N+/cm2注入劑量的大穗突變株的大穗特性得到保持。這表明，盡管離子束的誘變總體上表現(xiàn)為隨機性，但依作物品種和性狀選擇而定的不同誘變劑量還是相對能找到一個與之相對應(yīng)的最適選擇。從試驗中還可看出，所選的變異性狀在M3代雖得以保持，但還存在較大變幅，而且大部分還是優(yōu)良互摻的混合型變異，這就需要緊扣育種目標進一步與常規(guī)育種相結(jié)合對其世代進行穩(wěn)定或雜交改造。通過N離子束誘變可在相對短的時間內(nèi)獲得連麥6號的一些超親突變體，這不僅大大豐富了育種材料，也能提高育種效率。本試驗表明不同劑量的離子注入處理對小麥生理性狀影響的變異效應(yīng)不同，如何進一步提高小麥N離子束誘變效率，誘發(fā)篩選出符合育種目標的突變類型，豐富種質(zhì)資源，則是今后需要深化研究的方面。

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