何興楨 楊安 李曦

x[摘要] 目的 研究胃癌患者外周血CD4/CD8比例以及胃癌組織淋巴細胞活化基因3（LAG-3）陽性細胞/CCR類趨化因子受體3（CCR3）陽性細胞比例在胃癌發(fā)病機制中的意義。 方法 選取2013年1月～2014年12月在北京大學深圳醫(yī)院診斷的胃癌患者（胃癌組）20例及健康者（正常組）20名，采用流式細胞儀檢測和分析外周血中CD4/CD8比值，采用免疫熒光法檢測和分析LAG3+細胞/CCR3+細胞比值。 結(jié)果 胃癌組患者外周血中CD4+/CD8+比值為（1.68±0.87），正常組外周血中CD4+/CD8+比值為（1.80±0.52），與正常組比較，胃癌組有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。胃癌組患者LAG3+細胞/CCR3+細胞比值為（1.47±0.54），正常組LAG3+細胞/CCR3+細胞為（2.27±0.58），與正常組比較，胃癌組有下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 胃癌患者存在明顯的LAG3+細胞/CCR3+細胞比例失衡，一定程度上顯示胃癌患者存在著Th1/Th2比例失衡及免疫失衡，可能是胃癌發(fā)病的重要因素之一，為胃癌的免疫治療、臨床診斷提供新的方向。

[關(guān)鍵詞] CD4+/CD8+；LAG3+細胞/CCR3+細胞；胃癌；發(fā)病機制

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（b）-0104-04

[Abstract] Objective To investigate the significance of CD4/CD8 in peripheral blood and lymphocyte activation gene-3 （LAG3+） cells/ chemokine receptor 3 （CCR3+） cells in the pathogenesis of patients with gastric cancer. Methods Twenty patients with gastric cancer （gastric cancer group） and 20 healthy controls （normal group） diagnosed in Shenzhen Hospital of Peking University from January 2013 to December 2014 were chosen， the CD4/CD8 in peripheral blood was detected and analyzed by flow cytometry. LAG3+ cells/CCR3+ cells was detected and analyzed by analyzed linked immunosorbent assay. Results The CD4+/CD8+ in peripheral blood of gastric cancer group was （1.68±0.87）， which of normal group was （1.80±0.52）， compared with normal group， gastric cancer group was lower， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. LAG3+ cells/CCR3+ cells of gastric cancer group was （1.47±0.54）， which of normal group was （2.27±0.58）， compared with normal group， gastric cancer group was lower， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The patients with gastric cancer have a significant imbalance of LAG3+ cells/CCR3+ cells， to some extent， which shows that there is a proportion of Th1/Th2 and immune imbalance in patients with gastric cancer. And it may be one of the most important factors in the pathogenesis of gastric cancer， which provides a new direction for immune therapy and clinical diagnosis of gastric cancer.

[Key words] CD4+/CD8+； LAG3+ cells/CCR3+ cells； Gastric cancer； Pathogenesis

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年全世界因胃癌死亡的人數(shù)高達70萬名[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫功能的抑制和免疫狀態(tài)的異常密切相關(guān)[2]。T細胞亞群是在腫瘤免疫中具有重要作用的一類淋巴細胞，按其表面不同的分化抗原可分為CD4+T細胞（Th）和CD8+T（Ts/Tc）細胞兩大亞群。CD4+T細胞按其產(chǎn)生細胞因子的不同又可以分為Th1和Th2兩大亞型，其在機體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中具有重要作用。其中Th1介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，Th2介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。正常狀態(tài)下，T細胞及其亞群數(shù)目處在平衡狀態(tài)，免疫功能穩(wěn)定。CD4+T細胞產(chǎn)生淋巴因子，加強CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞的功能，具有輔助細胞和體液免疫的作用。CD8+T細胞是一類細胞毒性T細胞和抑制性T細胞，是一類效應(yīng)細胞，兩者平衡從而維持機體正常免疫應(yīng)答狀態(tài)[3]。LAG3在一定程度上作為Th1細胞的特異性標志，選擇性表達于人類Th1細胞[4]，CCR3選擇性表達于人類Th2細胞上[5]。本研究通過流式細胞儀檢測胃癌患者外周血中CD4+/CD8+比例，通過免疫熒光法檢測胃癌患者LAG3+細胞/CCR3+細胞的比例，探討CD4+/CD8+比例和LAG3+細胞/CCR3+細胞在胃癌患者發(fā)病機制中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2014年12月在北京大學深圳醫(yī)院（以下簡稱“我院”）門診或住院行內(nèi)鏡檢查，內(nèi)鏡下診斷胃癌并且最終經(jīng)過病理診斷明確的20例患者（胃癌組）作為研究對象；同時選擇內(nèi)鏡下表現(xiàn)正常且沒有糜爛、潰瘍或萎縮等其他表現(xiàn)（活檢最終符合病理診斷）的20名健康者（正常組）作為對照。胃癌組平均年齡（47.7±12.5）歲，其中男10例，平均年齡（52.2±14.0）歲，女10例，平均年齡（43.2±9.4）歲；正常組平均年齡（38.6±9.6）歲，其中男10名，平均年齡（41.0±9.4）歲，女10名，平均年齡（36.2±9.8）歲。提取患者血清5 mL備檢測，實驗獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀檢測患者CD4/CD8細胞比例 取患者外周血2 mL加入DETA抗凝管（或其他抗凝劑）中。分設(shè)試驗管3支，試驗管依次加10 μL熒光標記CD3/4/8/45，CD3-FITC/CD19-PE抗體10 μL+CD45-PC5抗體5 μL、CD3-FITC/16+56-PE抗體10 μL+CD45-PC5抗體5 μL。每管加入100 μL新鮮抗凝全血，充分混勻后在室溫暗處靜置15～30 min。標本與抗體的比例：標本檢測前應(yīng)先計算白細胞總數(shù)，使反應(yīng)體系中白細胞總數(shù)不超過5×105個細胞。若超過5×105個細胞，用PBS稀釋后反應(yīng)。取出試管：加500 μL OptilyseC，室溫避光10 min，加500 μL PBS，室溫避光10 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，0.5 mL PBS懸浮細胞，24 h內(nèi)檢測。流式細胞儀檢測：以CD45/SS雙參數(shù)方案設(shè)門淋巴細胞群，選擇CD3/4/8/45四色方案和CD3/CD16+56/CD45三色方案。標本上機后計數(shù)5000個淋巴細胞，測試完后由計算機進行數(shù)據(jù)分析。主要儀器及試劑如下：美國BeckmanCoulter公司NAVIOS型流式細胞儀。儀器序列號：AV40310，直接熒光標記單克隆抗體CD3/4/8/45、CD3/CD19、CD3/CD16+56、CD45-PC5購自法國Immunotech公司.

1.2.2 免疫熒光法檢測LAG3+細胞/CCR3+細胞比例 由我院病理科獲得患者胃癌組織切片，行二甲苯脫蠟2次，每次10 min。依次經(jīng)100%、95%、85%、75%、50%乙醇和純水各1次，每次5 min。PBS洗5 min。PBS洗3次，每次5 min。10%正常山羊血清封閉30 min。一抗4℃孵育過夜。PBS洗3次，每次5 min。熒光標記二抗室溫濕盒避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAPI室溫濕盒避光孵育5 min。PBS洗1次，5 min，去離子水洗2次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片；鏡檢，拍照。一抗Anti-CCR3生產(chǎn)商：Abcam；Anti-LAG3生產(chǎn)商：Abcam；二抗Goatanti-MsIgG生產(chǎn)商：LifeTech；Goatanti-RbIgG生產(chǎn)商：LifeTech；熒光顯微鏡生產(chǎn)商：Leica。對LAG3+、CCR3+細胞計數(shù)并進行分析。對每張切片隨機取5個高倍視野（200倍）對CCR3陽性細胞和LAG陽性細胞進行計數(shù)，5個高倍視野的平均值為該切片的平均陽性細胞數(shù)，每張切片由兩名觀察者進行判斷和讀片，并取平均值。最終計算LAG3+細胞/CCR3+細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，行t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組外周血中CD4+/CD8+比值為（1.68±0.87），正常組外周血中CD4+/CD8+比值（1.80±0.52）。與正常組比較，胃癌組有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）（圖1）。而免疫熒光法檢測提示胃癌組患者LAG3+細胞/CCR3+細胞比例為（1.47±0.54），正常組LAG3+細胞/CCR3+細胞比例為（2.27±0.58），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖2，封三），提示胃癌患者中存在著明顯的LAG3+細胞/CCR3+細胞比例失衡。

3 討論

胃癌在全球惡性腫瘤的發(fā)病率中排名第四，致死率排名第二[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與機體免疫功能異常密切相關(guān)[7-8]。腫瘤發(fā)生時常伴有機體免疫低下或者免疫抑制。胃癌作為一種常見腫瘤，它的發(fā)生和機體抗腫瘤免疫功能異常密切相關(guān)。

T細胞是對抗腫瘤免疫具有重要意義的效應(yīng)細胞，其數(shù)量和功能異常導(dǎo)致腫瘤細胞逃避宿主的免疫監(jiān)控。在正常情況下，機體T細胞及其亞群的數(shù)目相對穩(wěn)定，免疫功能穩(wěn)定。有研究表明，反映惡性腫瘤患者機體免疫功能紊亂的敏感性指標是CD4+/CD8+細胞比值[9]。比值異常增高，提示機體細胞免疫功能“過度活躍”，機體發(fā)生自身免疫反應(yīng)的概率增加；比值降低，提示機體處于“免疫抑制”狀態(tài)。臨床有研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血CD4/CD8細胞比值比正常人低下，說明胃癌患者存在不同程度的T細胞免疫功能異常[10-11]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組外周血中CD4+/CD8+比值較正常組下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）?？赡芘c本研究樣本量小、胃癌患者沒有具體分期、技術(shù)方案相對簡單有關(guān)，可以進一步擴大樣本容量來證實CD4+/CD8+比例是否下降，胃癌患者是否處于免疫抑制狀態(tài)。

LAG3是免疫球蛋白超家族中的一員。有研究證實其主要在CD4+T中的Th1細胞上表達，在大部分Th2細胞上不表達，提示可作為Th1、Th2細胞的區(qū)分標志[5]。但也有研究認為LAG3不能作為Th1細胞的特異性指標[12]。本研究檢測出胃癌組及正常組LAG3+細胞并計數(shù)。雖然LAG3+細胞計數(shù)不完全等同于Th1細胞計數(shù)，但其主要在Th1細胞上表達，一定程度上反映了Th1細胞計數(shù)。CCR3是G蛋白偶聯(lián)受體中的一種，其主要在Th2淋巴細胞、肥大細胞以及嗜酸性粒細胞上表達[13]。雖然CCR3在Th2細胞上選擇性表達，但是又可以與多種受體結(jié)合[14]，所以檢測出來的CCR3+細胞計數(shù)只能在一定程度上反映了Th2陽性細胞計數(shù)。由于目前缺乏Th1和Th2細胞表面特異性標志物，只能通過檢測細胞分泌的特征性細胞因子，間接檢測出Th1/Th2的比值。本研究通過得出LAG3+細胞/CCR3+細胞比例，間接反映Th1/Th2的比值。有待將來進一步研究加深對T細胞體內(nèi)分化及調(diào)控機制的認識，從而準確檢測出Th1/Th2比值，有利于實驗結(jié)果的準確分析，進一步促進胃癌的免疫診斷和治療。

LAG3在多種免疫類型中表達，主要在活化的T細胞和NK細胞上選擇性表達，其在部分活化的B細胞、腫瘤組織活化浸潤的CD4+T細胞、CD8+T細胞也有表達[15]。多項研究表明，LAG3能激活CD4+T細胞、CD8+T細胞，從而殺傷腫瘤細胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[16-17]，表明腫瘤細胞生長與機體的免疫狀態(tài)異常有關(guān)。CCR3主要在Th2淋巴細胞、肥大細胞以及嗜酸性粒細胞等各種免疫效應(yīng)細胞上表達[13]，其在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)，具體機制不詳，可能與機體免疫異常有關(guān)，有待未來的研究進一步證實。

Th1、Th2是CD4+T細胞的兩個重要亞群，機體正常狀態(tài)下Th1/Th2比值保持動態(tài)平衡[18]。在腫瘤等各種疾病狀態(tài)下，比值會發(fā)生改變、偏移甚至逆轉(zhuǎn)。有研究提示[19-20]，消化道腫瘤患者Th1、Th2之間的平衡向Th2漂移，呈現(xiàn)免疫功能抑制狀態(tài)，且腫瘤分化程度越低，失衡愈加明顯。本研究用免疫熒光法檢測LAG3+細胞/CCR3+細胞比值時使用一抗Anti-LAG3、Anti-CCR3，通過得出LAG3陽性細胞/CCR3陽性細胞比例失衡，一定程度上顯示胃癌患者中存在著明顯的Th1/Th2比例失衡，表明胃癌患者機體抗腫瘤免疫機制受損，這與眾多國內(nèi)外研究類似[21-23]。同時從側(cè)面反映出胃癌患者的免疫紊亂可能與Th1/Th2相關(guān)的趨化因子受體的異常表達有關(guān)，是胃癌的發(fā)病機制之一，那么阻礙其相關(guān)受體的作用途徑，可以為胃癌的早期診斷提供新的線索，為胃癌的治療提供新的靶點。探討LAG3+細胞/CCR3+細胞比值變化與胃癌發(fā)生的關(guān)系，深度剖析胃癌發(fā)生的免疫機制，從而為胃癌的免疫治療、臨床診斷提供新的方向。

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（收稿日期：2015-12-12 本文編輯：張瑜杰）