田茜 段乃彬 李群

摘要：以玉米品種“鄭單958”種子為材料，研究了種子人工老化過程中超弱發(fā)光（ultraweak luminescence，UWL）的變化及其與種子活力、相對(duì)電導(dǎo)率、ATP含量的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)、UWL強(qiáng)度、ATP含量均逐漸下降，相對(duì)電導(dǎo)率逐漸升高；UWL強(qiáng)度與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和ATP含量顯著正相關(guān)，與相對(duì)電導(dǎo)率顯著負(fù)相關(guān)。表明，UWL與以ATP含量為標(biāo)志的能量水平密切相關(guān)；UWL作為一種無損、靈敏、快速的物理檢測(cè)指標(biāo)，可應(yīng)用于種子活力無損檢測(cè)研究。

關(guān)鍵詞：玉米種子；人工老化；種子活力；超弱發(fā)光；ATP

中圖分類號(hào)：S513.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）08-0030-04

AbstractThe seeds of maize （Zea mays L.） variety Zhengdan 958 were used to study the change of ultraweak luminescence （UWL） intensity and its relationship with seed vigor， relative electric conductivity and ATP content during artificial aging. The results indicated that the germination percentage， germination potential， germination index， UWL intensity and ATP content decreased gradually， while the relative electric conductivity increased with the prolongation of artificial aging. The correlation analysis showed that UWL intensity was significantly positively correlated with germination percentage， germination potential， germination index and ATP content， while significantly negatively correlated with relative electric conductivity. It was concluded that UWL was closely related to the energy level symbolized by ATP content， and as a fast nondestructive physical indicator with better sensitivity， it could be applied into the study of seed vigor nondestructive testing.

KeywordsMaize seed； Artificial aging； Seed vigor； Ultraweak luminescence； ATP

超弱發(fā)光（ultraweak luminescence，UWL）是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中自發(fā)輻射的一種極弱的光子流，其強(qiáng)度為每秒每平方厘米幾個(gè)到幾百個(gè)光子，波長(zhǎng)范圍為200～800 nm[1]。與熒光素—熒光素酶體系的高效率生物發(fā)光不同，UWL是一種極其微弱的低水平發(fā)光[2]。研究表明，UWL與生物體許多重要的生命過程，如細(xì)胞分裂、氧化代謝、DNA合成、細(xì)胞凋亡、光合作用、細(xì)胞間的信息傳遞、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及能量轉(zhuǎn)換等密切相關(guān)[3-6]，能靈敏地反映出生物系統(tǒng)的生理狀態(tài)，因此可作為反映植物體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換活躍程度的一項(xiàng)靈敏指標(biāo)[7，8]，已被應(yīng)用于植物種子活力檢測(cè)研究中。

傳統(tǒng)的種子活力檢測(cè)方法——直接法和間接法（即發(fā)芽實(shí)驗(yàn)法和生化法）屬有損檢測(cè)方法，不僅會(huì)破壞種子的組織結(jié)構(gòu)，而且操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)。種子在吸脹或萌發(fā)期間處于活躍的生長(zhǎng)期，超弱發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)，一般在250～700個(gè)光子·cm-2·s-1左右，相對(duì)容易探測(cè)。有研究表明，萌發(fā)的水稻、花生種子活力與UWL強(qiáng)度密切相關(guān)[9，10]。然而種子一旦萌發(fā)將無法繼續(xù)保存或使用，因此通過測(cè)定種子萌發(fā)期UWL來檢測(cè)其活力的方法也具有損傷性。

基于干種子UWL強(qiáng)度的種子活力檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷、靈敏度高和無損傷的特點(diǎn)，已成為種子活力無損檢測(cè)研究中一個(gè)新的發(fā)展方向。干種子UWL強(qiáng)度與其活力關(guān)系的研究是種子無損檢測(cè)的理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，小麥貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，UWL強(qiáng)度越低，UWL強(qiáng)度與小麥新陳度之間有良好的相關(guān)性[11，12]；張文蘭等[13]對(duì)中期庫保存的小麥、水稻、玉米、大豆研究發(fā)現(xiàn)，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，UWL強(qiáng)度逐漸下降，UWL與發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)極強(qiáng)的正相關(guān)；王春芳等[14]利用UWL技術(shù)檢測(cè)水稻和小麥的發(fā)芽率，并建立了基于UWL強(qiáng)度的發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，可很好地預(yù)測(cè)水稻和小麥種子貯藏期間的發(fā)芽率。本研究以人工老化的玉米種子為材料，探討了人工老化過程中超弱發(fā)光與種子活力、相對(duì)電導(dǎo)率、ATP含量的關(guān)系，以期為種子活力的快速無損檢測(cè)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料與處理

供試材料為玉米（Zea mays L.）品種“鄭單958”的種子。由山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心提供，種子初始含水量為 11.7%，發(fā)芽率為99%。將玉米種子密封于鋁箔袋中，置于60℃人工老化箱中分別老化0、6、12、18、24 h，然后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1種子發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)定老化后的種子室溫平衡兩天后，參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》[15]（GB/T3543.3-1995）進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)：隨機(jī)選取經(jīng)老化處理的種子100粒放入發(fā)芽盒，重復(fù)4次，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)。萌發(fā)第3 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2種子自身超弱發(fā)光的測(cè)量采用中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研制的微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x（BPCL）進(jìn)行測(cè)量。整個(gè)檢測(cè)過程在暗室及恒溫[（25±1）℃]恒濕（RH 75%±2%）下進(jìn)行。選取大小一致的種子10粒，先置于暗室中30 min消除干擾，隨后平鋪于測(cè)量杯中測(cè)量其發(fā)光強(qiáng)度，測(cè)量時(shí)間為100 s，測(cè)量時(shí)間間隔1 s，重復(fù)3次，取平均值，減去本底值即為種子的自身發(fā)光強(qiáng)度。發(fā)光強(qiáng)度以單位時(shí)間單粒種子所發(fā)射光子數(shù)（counts·s-1·粒-1）表示。

1.2.3電導(dǎo)率測(cè)定隨機(jī)選取10粒凈種子，重復(fù)3次，用蒸餾水沖洗3次，再用濾紙吸干浮水，置于三角瓶中，加入25 mL蒸餾水，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中浸泡24 h。用電導(dǎo)率儀（Mettler-Toledo Delta 326）測(cè)定浸出液電導(dǎo)率，測(cè)完后將三角瓶置于100℃水浴中煮沸15 min，取出冷卻至室溫，測(cè)定煮沸后浸出液的電導(dǎo)率，計(jì)算種子相對(duì)電導(dǎo)率，公式如下：

相對(duì)電導(dǎo)率（%）=煮沸前浸出液電導(dǎo)率/煮沸后浸出液電導(dǎo)率×100。

1.2.4種子ATP含量測(cè)定采用熒光素酶—熒光素生物發(fā)光法，參照王維光等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1人工老化過程中種子活力的變化

表1顯示，隨著人工老化處理進(jìn)程，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)逐漸下降。與對(duì)照相比，人工老化處理12 h后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著降低，老化24 h后，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別降至83.00%、70.00%；而發(fā)芽指數(shù)在老化6 h后就顯著下降，且各處理間差異顯著。表明，隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子老化程度逐漸加深，種子活力下降。

2.2人工老化過程中種子超弱發(fā)光的變化

由圖1可知，老化種子的UWL強(qiáng)度隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)。老化6 h和12 h的種子UWL強(qiáng)度與對(duì)照相比差異不顯著，而老化18、24 h后，玉米種子的UWL強(qiáng)度與對(duì)照相比分別下降25.53%、41.69%，差異顯著。表明，隨著老化進(jìn)程的加深，種子內(nèi)部生理代謝速率降低。

2.3人工老化過程中種子相對(duì)電導(dǎo)率的變化

由圖2可知，玉米種子的相對(duì)電導(dǎo)率隨老化處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)。老化18、24 h后的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比差異顯著，分別比對(duì)照升高13.07%、14.99%。說明隨著老化程度的加深，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，膜透性增大，內(nèi)含物大量外滲。

2.4人工老化過程中種子ATP含量的變化

ATP是維持生命活動(dòng)最重要的能量物質(zhì)，可反映細(xì)胞的代謝狀況和能量水平，在種子萌發(fā)過程中具有十分重要的作用。圖3顯示，種子ATP含量隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，除老化6 h的ATP含量與對(duì)照差異不顯著外，其它老化處理均與對(duì)照差異顯著。人工老化12、18、24 h后，ATP含量分別比對(duì)照降低2.63%、3.76%、5.16%。老化種子中ATP含量與UWL的變化趨勢(shì)相一致，ATP含量的降低可能是導(dǎo)致UWL強(qiáng)度降低的原因之一。

2.5相關(guān)性分析

由表2可以看出， UWL強(qiáng)度與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)顯著正相關(guān)，相對(duì)電導(dǎo)率與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)極顯著負(fù)相關(guān)，ATP含量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)極顯著正相關(guān)，UWL強(qiáng)度與ATP含量顯著正相關(guān)，與相對(duì)電導(dǎo)率顯著負(fù)相關(guān)。說明UWL強(qiáng)度受種子內(nèi)部能量代謝和脂質(zhì)過氧化程度的影響。

3討論與結(jié)論

超弱發(fā)光與許多基本生命過程關(guān)系密切，是反映有機(jī)體生理生化反應(yīng)狀態(tài)的特征性指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著老化程度的加深，種子生活力下降，UWL強(qiáng)度也隨之下降，且UWL強(qiáng)度與種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及ATP含量呈顯著正相關(guān)，說明UWL強(qiáng)度能在一定程度上反映種子的生命活動(dòng)狀態(tài)。這與張文蘭[13]、王春芳[14]等的研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步說明了UWL可應(yīng)用于種子活力無損檢測(cè)研究，為種子活力檢測(cè)提供一種無損、快速、準(zhǔn)確和客觀的方法。

植物UWL是與植物能量代謝相聯(lián)系的低水平光子輻射[17]。ATP含量能夠反映植物本身的能量狀況，維持一定水平的ATP對(duì)于種子萌發(fā)至關(guān)重要。任何生成或消耗ATP、NAD（H2）、FMN（H2）的反應(yīng)均可導(dǎo)致一部分代謝能以光子的形式釋放出來，而出現(xiàn)UWL[18，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在種子老化過程中， ATP含量逐漸降低，UWL也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，二者呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.954。這說明在種子老化過程中，以ATP含量為標(biāo)志的能量水平降低可能是導(dǎo)致UWL降低的主要原因。這與張新華[20]、林桂玉[21]等的研究結(jié)果一致。

綜上所述，在種子老化過程中，UWL強(qiáng)度與發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)電導(dǎo)率和ATP含量等生理指標(biāo)的變化密切相關(guān)，可用于種子活力的無損檢測(cè)，但對(duì)于其他作物種子或相同種子其他脅迫條件下是否可用還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張新華，楊洪強(qiáng). 植物的超微弱發(fā)光[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2003， 34（4）： 605-608.

[2]楊海蓮，王紅梅，于家峰， 等. 溫度脅迫對(duì)葉片超弱發(fā)光的影響[J]. 四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2008，31（4）：468-470.

[3]朱冠宇，劉歡，梁爽，等. 草莓果實(shí)發(fā)育成熟過程中超微弱發(fā)光的變化[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技， 2015， 43（3）： 9-11.

[4]張新華，李富軍，申琳， 等. 超弱發(fā)光技術(shù)在植物逆境生理研究中的應(yīng)用[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2009， 45（9）：931-935.

[5]Yan Y， Popp F A， Rothe G M. Correlation between germination capacity and biophoton emission of barley seeds （Hordeum vulgare L.） [J]. Seed Sci. Technol.， 2003， 31（2）： 249-258.

[6]Costanzo E， Gulino M， Lanzano L，et al. Single seed viability checked by delayed luminescence [J]. Euro. Biophys. J. ， 2008， 37（2）： 235-238.

[7]張菊平，張興志，鞏振輝. 超微弱發(fā)光在蔬菜研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006， 22（1）： 220-222.

[8]袁佐清. 生物超微弱發(fā)光研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008，36（8）：3092-3094.

[9]Chen W L， Xing D， He Y H. Determination the vigor of rice seed with different degrees of aging with ultraweak chemiluminescence during early imbition[J]. Acta Bot. Sin.， 2002， 44（11）：1376-1379.

[10]Chen W L， Xing D， Wang J， et al. Rapid determination of rice seed vigour by spontaneous chemiluminescence and singlet oxygen generation during early imbibition[J]. Luminescence， 2003， 18 （1）： 19-24.

[11]鮑杰，吳才章. 基于虛擬儀器的小麥活力檢測(cè)[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)， 2011， 26（6）： 102-105.

[12]吳才章，徐振方，王繼偉. 小麥發(fā)光特性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)， 2014， 29（4）： 78-81.

[13]張文蘭，田茜，李群，等. 低溫保存對(duì)4 種作物種子超弱發(fā)光特性影響規(guī)律的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 46（12）： 38-42.

[14]王春芳，詹耀，胡菲菲，等. 基于超弱發(fā)光技術(shù)的稻谷和小麥種子發(fā)芽率檢測(cè)[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)， 2003， 28（2）： 105-199.

[15]國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局. GB/T3543.3 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 1995.

[16]王維光， 顧儉本. 從葉片中提取ATP方法的比較[J]. 植物生理學(xué)通訊， 1986 （5）： 54-55.

[17]王維光， 韓俊英. 生物超弱發(fā)光機(jī)制及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 17（1）： 49-54.

[18]Ables F B. Plant chemiluminescence [J]. Anun. Rev. Plant Physiol.， 1986， 37： 49-72.

[19]王華芳，尹偉倫，鄭彩霞，等. 植物的超弱發(fā)光[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1996， 18 （2）：83-89.

[20]張新華，楊洪強(qiáng)，李富軍， 等. 杏花開放過程中超微弱發(fā)光和ATP及活性氧含量的變化[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 30 （1）：41-44.

[21]林桂玉，黃在范，張翠華，等. 菊花花芽分化期超微弱發(fā)光及其生理代謝的變化[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（12）：1819-1824.