白金萍 劉芳 李麗

【摘 要】 實時熒光定量RT-PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)基團，并通過實時熒光定量PCR儀，進行實時、自動檢測整個PCR擴增過程中的熒光信號，從而對擴增產(chǎn)物進行實時定量分析的方法。它具有高靈敏、高通量、定量準(zhǔn)確、可重復(fù)、污染少等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因診斷，病毒篩選，細胞和組織中RNA的定量等。在采用RT-PCR進行研究的過程中，我們通常需要加入內(nèi)參基因作為參考，內(nèi)參基因又稱為管家基因，它主要是用來平衡樣本之間濃度和純度的差異，減少實驗誤差，使得實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確，所以內(nèi)參基因的選擇尤為重要。

【關(guān)鍵詞】 實時 熒光定量RT-PCR 內(nèi)參基因

1 理想內(nèi)參基因的選擇

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：①不存在假基因（pseudogene）， 以避免基因組 DNA的擴增；②高度或中度表達， 排除太高或低表達；③穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞）， 而且其表達量是近似的，無顯著性差別；④表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關(guān)；⑤其穩(wěn)定的表達水平與目標(biāo)基因相似；⑥不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響， 如不受任何實驗處理措施的影響。排除內(nèi)參基因的條件則為：①在正常和異常的細胞/組織中的表達存在差異；②呈現(xiàn)細胞周期依賴的表達；③定位于 X染色體[1]。

2 內(nèi)參基因選擇存在的誤區(qū)

我們做RT-PCR實驗時通常存在兩個誤區(qū)，①選擇常用的內(nèi)參基因，沒有經(jīng)過實驗進行篩選，如β-actin、18SrRNA、B2M等是我們常選擇的內(nèi)參基因，但有研究表明β-actin 當(dāng)細胞向惡性轉(zhuǎn)化時，表達量會增加；B2M在軟骨細胞、吞噬細胞中均能夠穩(wěn)定表達，但在骨髓間充質(zhì)干細胞中表達較差[2，3]。②只選擇一個內(nèi)參基因校正數(shù)據(jù)，而目前沒有一種內(nèi)參基因可以適用于所有的組織和細胞，以及能夠滿足各種不同的實驗條件，如錯誤的選擇一種內(nèi)參基因，可能導(dǎo)致實驗結(jié)果的錯誤，甚至與結(jié)論背道而馳，所以選擇2個或以上的內(nèi)參基因有助于發(fā)現(xiàn)偏差，以確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 內(nèi)參基因的不穩(wěn)定性

GAPDH和β-actin是常選擇的內(nèi)參基因，但Glare等研究發(fā)現(xiàn)在哮喘氣道組織中這兩個內(nèi)參基因表達并不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參校正數(shù)據(jù)[4]。Radonic等證實GAPDH和β-actin這兩個內(nèi)參基因明顯地受有絲分裂原刺激的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出在實驗條件下細胞內(nèi)看家基因的激活[5]。也有研究報道Let-7a在結(jié)直腸癌中表達穩(wěn)定適合作為內(nèi)參基，，而另有實驗證明Let-7a對結(jié)直腸癌有抑癌作用，不適合作為內(nèi)參基因[6，7]。

4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

由于內(nèi)參基因在不同實驗條件下、不同組織和細胞中表達量不同，甚至差異明顯，這為內(nèi)參基因的選擇出了難題。針對這一問題，Jo Vandesompele，Claus 和 Michael等分別編寫 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序用于進行比較內(nèi)參基因的表達變化和穩(wěn)定性評價[8，9]，以便篩選出表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因，保證實驗結(jié)果的真實性。

GeNorm程序是Jo Vandesompele于2002年編寫的專門用來篩選RT-PCR內(nèi)參基因的程序，后來該程序得到進一步改進[10]，其核心原理是：無論在何種實驗條件下或何種細胞內(nèi)，兩個理想內(nèi)參基因表達水平的比值應(yīng)該在所有標(biāo)本中一致，表達水平不受基因間表達豐度差別和極端比值的影響，比值變異度的增加意味著二者中其一或全部基因表達穩(wěn)定性的降低。該程序主要通過計算某一基因與其他所有基因間兩兩比值的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均變異度M作為基因穩(wěn)定性的評價指標(biāo)， M 值越小，表示內(nèi)參基因的表達越穩(wěn)定，確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并通過對標(biāo)準(zhǔn)化因子進行配對差異分析來判定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目[11-13]。

NormFinder程序是基于一個固定的統(tǒng)計學(xué)框架方差分析，通過測定每個基因的穩(wěn)定值，根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，最終將表達穩(wěn)定值最小的基因作為最穩(wěn)定的基因。但是它的不足之處在于只能選擇1個最合適的內(nèi)參基因[14]。

BestKeeper程序可以分析基因表達穩(wěn)定性和基因表達水平，它通過把原始數(shù)據(jù)輸入BestKeeper軟件的Excel表格中，對內(nèi)參基因和目標(biāo)基因進行單獨分析。它的優(yōu)點是不僅可以分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性還可以比較目標(biāo)基因的表達水平，這是GeNorm和NormFinder程序不能達到的。但BestKeeper 程序只能計算一次配對相關(guān)系數(shù)，當(dāng)排除某個基因后該程序不能重新計算，這也是其不足之處。

內(nèi)參基因選擇是否正確直接影響著實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，這三種內(nèi)參基因分析軟件分別采用不同的統(tǒng)計學(xué)分析方法，從不同方面幫助篩選適合的內(nèi)參基因，綜合三種軟件分析的結(jié)果，可為正確選擇內(nèi)參基因提供更加可靠的依據(jù)。

參考文獻

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