劉曉波 顧靖華 許驥 陳新 何佳 陳海庭 陳銳勇

[摘要] 目的 該研究探索過度激活的Rho/ROCK信號通路在缺血再灌注損傷中的參與機制及貝那普利的改善作用。 方法 SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、Y27632組和貝那普利組。采用大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎法復制心肌缺血再灌注模型，Y27632組和貝那普利組分別給予對應藥物灌胃治療。分析各組血清中MDA、SOD、GSHpx、Rho/ROCK、MMP2/9及Bax/Bcl2和Caspase3/9的表達。結(jié)果 模型組血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明顯降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表達明顯增強（0.25→0.68）。Y27632和貝那普利組大鼠的上述異常得到顯著的改善。結(jié)論 貝那普利通過抑制過度激活的Rho/ROCK、激活的細胞凋亡信號通路、改善細胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)發(fā)揮保護缺血再灌注大鼠心肌損傷的作用。

[關鍵詞] Rho/ROCK通路；缺血再灌注；心肌損傷；貝那普利；細胞凋亡

[中圖分類號] R614 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）03（c）-0117-04

Participation Mechanism of Excessively Activated Rho/ROCK Signaling Pathway in Cardiac Reperfusion Injury and Improvement Effect of Benazepril

LIU Xiao-bo， GU Jing-hua， XU Ji， CHEN Xin， HE Jia， CHEN Hai-ting， CHEN Rui-yong

Diving Medical Research Laboratory，Naval Medical Research Institute of PLA， Shanghai， 200433 China

[Abstract] Objective To study the participation mechanism of excessively activated Rho/ROCK signaling pathway in cardiac reperfusion injury and improvement effect of benazepril. Methods The SD rats were randomly divided into 4 groups， namely sham operation group， ischemic reperfusion group， Y27632 group and benazepril group， the cardiac reperfusion injury model was copied by ligating the left anterior descending coronary artery in rats， the Y27632 group and benazepril group were respectively treated with corresponding drug gavage， the expressions of MDA， SOD， GSHpx， Rho/ROCK， MMP2/9， Bax/Bcl2 and Caspase3/9 in serum of all groups were analyzed. Results The serum NDA level in the model group obviously increased （15.6→24.1 μg/mL）， but the SOD （83.1→34.6 U/mL） level obviously decreased， the expressions of Rho/ROCK （0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）， MMP2/9 （0.28→0.60；0.27→0.63） and Caspase9 were obviously enhanced （0.25→0.68）， the above abnormalities in the Y27632 group and benazepril group were obviously improved. Conclusion Benazepril plays a protection role in rats with cardiac reperfusion injury by suppressing the excessively activated Rho/ROCK， activated cell apoptosis signaling pathway and improving extracellular matrix degradation and reconstruction.

[Key words] Rho/ROCK signaling pathway； Ischemia reperfusion； Myocardial injury； Benazepril； Apoptosis

缺血再灌注損傷即在一定條件下機體恢復血液再灌注后缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象[1-3]。缺血再灌注可引起機體多種器官的損傷，尤其是心肌組織，但對其損傷的確切機制尚未完全闡明。Rho/ROCK（Ras homologue/Rho Associate Kinase）信號通路機體內(nèi)存在的一種與細胞的生長、增殖和分化有關的信號通路，廣泛參與機體的多種病理及生理過程[4-5]。Rho/ROCK信號通路主要由Rho蛋白、ROCK1和ROCK2蛋白組成，通過上調(diào)下游系列蛋白發(fā)揮作用[6]。研究共使用SD大鼠24只，自2013年5月—2014年12月在該單位實驗中心完成。該研究探索過度激活的Rho/ROCK信號通路在缺血再灌注損傷中的參與機制及貝那普利的改善作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

24只8周齡SD大鼠購自浙江省實驗動物中心，雌性不拘，體重220～240 g，許可證號SZXK（浙）20080033，動物于（55±5）%濕度，（20±2）℃條件下給予標準飼料適應性飼養(yǎng)1周，自由飲食；Y27632、貝那普利均購自美國Sigma Aldrich公司；RhoA、ROCK1/2、MMP2/9及Caspase3/9一抗均購自美國Santa Cruz；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德公司；其余試劑均為市售分析純。所有操作均符合上海市實驗動物管理條例。

1.2 缺血再灌注大鼠模型復制

所有大鼠適應性飼養(yǎng)一周，自由飲食。24只SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、Y27632組及貝那普利組（n=6）。采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎大鼠建立大鼠心肌缺血再灌注模型：結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支前0.5 h從右腔靜脈注射生理鹽水，結(jié)扎左前降支0.5 h后松開并再行灌注2 h。假手術(shù)組僅穿線但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。Y2632組（20 mg/kg）和貝那普利組（20 mg/kg）于結(jié)扎前0.5 h于右腔靜脈注射相應藥物。造模結(jié)束后逐層縫合肌肉、皮膚，大鼠手術(shù)切口處注射少許青霉素注射液防止手術(shù)感染。

1.3 生化指標及免疫印跡法

血清MDA、SOD及GSHpx試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。所有實驗操作均嚴格按照說明書進行。免疫印跡法參照以往報道方法進行[5]。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用 t 檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注大鼠異常的MDA、SOD及GSHpx

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD水平明顯降低（83.1→34.6U/mL）（P=0.006），而貝那普利和Y27632對上述異常有顯著的改善作用（P=0.008），見圖1。

2.2 缺血再灌注大鼠異常表達的RhoA及ROCK1/2

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠心肌組織RhoA（0.18→0.64）及ROCK1/2（0.19→0.69；0.16→0.65）水平明顯增高（P=0.004，P=0.002，P=0.003），而貝那普利和Y27632對上述異常有顯著的改善作用（P=0.005，P=0.003，P=0.007），見圖2。

2.3 缺血再灌注大鼠異常表達的MMP2/9

2.4 缺血再灌注大鼠異常表達的Caspase3/9

3 討論

缺血再灌注存在于多種病理過程中，會對機體多種組織造成嚴重的損傷，尤其是心肌組織。心肌缺血再灌注損傷表現(xiàn)為心肌組織中心肌細胞壞死、細胞內(nèi)存在過多氧自由基，甚至發(fā)生細胞凋亡，并導致心律失常或心室收縮力減弱[7]。該研究探索過度激活的Rho/ROCK信號通路在缺血再灌注損傷中的參與機制及貝那普利的改善作用是發(fā)現(xiàn)模型組血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明顯降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表達明顯增強（0.25→0.68）。Y27632和貝那普利組大鼠的上述異常得到顯著的改善。因此，貝那普利通過抑制過度激活的Rho/ROCK、激活的細胞凋亡信號通路改善缺血再灌注大鼠心肌損傷。

ROCK是與細胞凋亡相關的激酶，參與調(diào)解細胞的多種生理功能，如增殖、分化、凋亡、收縮及粘附等。在心血管系統(tǒng)中，RhoA/ROCK通路也與血管再狹窄、肺動脈高壓、心肌肥厚、高血壓以及心力衰竭等病理過程密切相關。研究證實，壓力負荷可以促進心肌肥厚的發(fā)生及發(fā)展過程，且此過程中存在RhoA/ROCK相關蛋白的上調(diào)表達（RhoA：126.2%；ROCK1：108.8%），而藥物干預可以通過抑制上調(diào)的RhoA/ROCK表達（RhoA：123.5%；ROCK1：105.1%）改善心肌肥厚的進展[8]。與上述研究結(jié)論相似，該研究也發(fā)現(xiàn)冠狀動脈前降支結(jié)扎復制的缺血再灌注心肌損傷模型中心肌組織RhoA及ROCK1/2的表達明顯增強（RhoA：0.18→0.64；ROCK1：0.19→0.69；ROCK：0.16→0.65），而內(nèi)那普利可以顯著抑制該通路的異常發(fā)揮抑制心肌損傷的作用。該研究中也證實，冠狀動脈前降支結(jié)扎復制的缺血再灌注心肌損傷模型中心肌組織中促凋亡蛋白Caspase9表達明顯增強，而內(nèi)那普利可以通過抑制ROCK通路抑制心肌細胞的凋亡。但是，該研究中所采用的Y27632為特異性的ROCK蛋白抑制劑，而對Rho蛋白表達無明顯的調(diào)控作用。在以后的研究中將采用Rho蛋白特異性抑制劑進行干預，進一步分析Rho/ROCK通路中各個蛋白在此病理過程中的具體作用，為臨床精準治療提供參考。

因此，貝那普利通過抑制過度激活的Rho/ROCK、激活的細胞凋亡信號通路、改善細胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)發(fā)揮缺血再灌注大鼠心肌損傷的保護作用。

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