王帥　廖秋萍　賈琦珍　陳根元

摘要：探討小花棘豆（Oxytropis glabraD C）中毒對(duì)和田羊內(nèi)臟器官α-甘露糖苷酶（AMA）的影響，進(jìn)一步揭示小花棘豆的毒性作用機(jī)理。將12只和田羊隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組。試驗(yàn)組分別按10g/kg和20g/kg的劑量飼喂小花棘豆，飼喂至出現(xiàn)典型中毒癥狀。屠宰后每組隨機(jī)采集試驗(yàn)羊的肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟，檢測(cè)和田羊內(nèi)臟器官AMA活性及表達(dá)的變化。結(jié)果表明，和田羊肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟中高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMA1）和溶酶體α-甘露糖苷酶（AMA2）均有表達(dá)。試驗(yàn)I組和田羊各器官的AMA2的表達(dá)均與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟和腎臟AMA2的表達(dá)顯著低于對(duì)照（P<0.05），但其余器官AMA2的表達(dá)均與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)lI組和田羊肝臟和腎臟AMA1的表達(dá)極顯著低于對(duì)照（P<0.01），脾臟AMAl的表達(dá)顯著低于對(duì)照（P<0.05）；試驗(yàn)Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟AMA1的表達(dá)顯著低于對(duì)照（P<0.05），其余器官AMAl的表達(dá)均與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。不同劑量小花棘豆均可降低和田羊內(nèi)臟中AMA活性及其mRNA表達(dá)量，肝臟和腎臟是其主要作用的靶區(qū)。

關(guān)鍵詞：小花棘豆（Oxytropis glabra DC）；苦馬豆素；α-甘露糖苷酶；內(nèi)臟器官

中圖分類(lèi)號(hào)：S856.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2308-05

小花棘豆（Oxytropis glabra DC）是廣泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐貧瘠、返青早、生命力強(qiáng)、繁殖系數(shù)高等特性。是制約新疆草原畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。目前僅南疆阿克蘇、和田地區(qū)天然草場(chǎng)中廣泛叢生小花棘豆的面積已超過(guò)20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜總數(shù)的5%-10%，其中50%左右的中毒家畜死亡。中毒家畜表現(xiàn)為機(jī)體的廣泛性損傷，剖檢發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟器官多出現(xiàn)腫脹等炎癥，病理組織學(xué)表現(xiàn)主要為細(xì)胞空泡變性。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素（Swainsonine，SW）是小花棘豆的主要毒性成分，可通過(guò)抑制α-甘露糖苷酶（oL-Mannosidase，AMA）活性，導(dǎo)致機(jī)體甘露糖代謝發(fā)生異常而發(fā)揮毒性作用。研究表明，AMA是動(dòng)物小花棘豆中毒特異性最強(qiáng)的指標(biāo)，小花棘豆中毒動(dòng)物的AMA活性受到顯著抑制，但對(duì)其轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾等的影響尚不清楚。和田羊是新疆南疆地區(qū)的主要放牧品種，占該地區(qū)綿羊存欄數(shù)的70.97%，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。近年來(lái)，和田羊小花棘豆中毒已成為該地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展面臨的嚴(yán)重問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)ELISA、免疫組化和熒光實(shí)時(shí)定量PCR。以新疆南疆地區(qū)小花棘豆為試驗(yàn)材料，研究小花棘豆攻毒對(duì)和田羊內(nèi)臟器官AMA活性及分布、表達(dá)的影響。為揭示小花棘豆中毒機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康和田羊12只，雌雄各半，體重（32±1.4）kg，購(gòu)自同一牧場(chǎng)。小花棘豆風(fēng)干樣采自阿克蘇市溫宿縣佳木鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。

S-P超敏組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）；AMA檢測(cè)試劑盒（南京建成生物技術(shù)公司）：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒，均購(gòu)自TAKARA（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

試驗(yàn)羊隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組。每組4只。對(duì)照羊自由采食青干草。每只每日補(bǔ)飼精料300g，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組飼喂小花棘豆粉，每天分別按10g/kg和20g/kg的劑量與300g精料加水混勻，飼喂3次，即08：00-09：00、14：00M5：00、19：00-20：00，自由采食后飼喂青干草。自由飲水。待出現(xiàn)喜臥、起立困難、以手提耳出現(xiàn)搖頭等典型中毒癥狀后進(jìn)行屠宰，分別取肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟組織，部分進(jìn)行免疫組化染色分析，部分利用冰生理鹽水制備10%組織勻漿液用于檢測(cè)AMA活性，部分液氮保存用于檢測(cè)mRNA水平表達(dá)的影響。所有解剖工具及凍存管均需用DEPC預(yù)處理。

1.3 AMA在中毒羊內(nèi)臟器官組織的分布

和田羊內(nèi)臟器官組織均使用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。包埋組織進(jìn)行連續(xù)切片，片厚6μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，然后按照試劑盒說(shuō)明操作。其中抗體稀釋比為1/100，DAB顯色。使用PBS為陰性對(duì)照。常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。采用hnage-ProPlus6.0軟件對(duì)免疫組化獲得照片進(jìn)行分析。

1.4 AMA活性測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用間接ELISA法測(cè)定和田羊內(nèi)臟器官組織中AMA活性。具體步驟為：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋→加樣→溫育→洗滌→加酶→溫育→洗滌→顯色→終止→測(cè)定。

1.5 AMA表達(dá)水平的測(cè)定

1.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中綿羊高

爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMAl）、溶酶體α-甘露糖苷酶（AMA2）和Bβ-actin基因的核苷酸序列，采用BeaconDesigner軟件設(shè)計(jì)引物，引物見(jiàn)表1，由TAKARA（大連）有限公司合成。

1.5.2 總RNA提取與cDNA合成 參照TAKARA總RNA提取試劑盒（D9108）說(shuō)明書(shū)提取綿羊待測(cè)組織總RNA，通過(guò)檢測(cè)OD_260nm和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，將合格RNA利用gDNAEraser去除基因組DNA，反應(yīng)條件：42℃，2min。然后采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：PrimeScriptBuffer5x4.0μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，RNA提取液10.0μL，RNaseFreedH₂O4.0μL：反應(yīng)條件：37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s，-20℃保存。

1.5.3 普通PCR及基因測(cè)序 PCR反應(yīng)體系：2xTaq PCR Master Mix12.5μL，模板cDNA2.0μL，上、下游引物各2.0μL，ddH₂O6.5μL；各反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min：94℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)：72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至TAKARA（大連）有限公司測(cè)序。

1.5.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和田羊內(nèi)臟器官中AMA的相對(duì)表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 2×10，0μL，上、下游引物各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ50×0.4μL，cDNA液2.0μL，RNaseFreeddH₂O6，0μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s：95%變性5s，60℃退火34s，72℃延伸30s。40個(gè)循環(huán)：72℃延伸10min。按反應(yīng)體系及條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到各部分Ct值，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法對(duì)所得實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，通過(guò)One-WayANOVA方法分析單因素方差，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMA在和田羊內(nèi)臟器官組織中的分布

由圖1可知，AMA在和田羊的肝臟組織、腎臟皮質(zhì)區(qū)、腎臟髓質(zhì)區(qū)、脾臟紅髓、脾臟白髓、脾臟小梁、心肌組織、肺泡組織等區(qū)域均有分布。但在肝臟中央靜脈、小葉間靜脈、小葉間動(dòng)脈、腎小球細(xì)胞和腎小管細(xì)胞中染色極淡，表明在這些區(qū)域AMA表達(dá)較弱或不表達(dá)。小花棘豆攻毒羊肝細(xì)胞、腎臟皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)細(xì)胞、脾臟紅髓、脾臟小梁中AMA的染色明顯變淡。其中試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝細(xì)胞、腎臟皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)細(xì)胞中AMA免疫組化染色極淡，表明這些區(qū)域AMA已經(jīng)幾乎不表達(dá)。

2.2 引物的可靠性驗(yàn)證

由圖2可知，β-actin在100bp左右出現(xiàn)條帶，AMA1和AMA2基因分別在100bp和200bp間出現(xiàn)2條清晰條帶，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的條帶大小相符，表明引物設(shè)計(jì)良好。

2.3 和田羊內(nèi)臟器官AMA活性的變化

由表2可知，試驗(yàn)組和田羊內(nèi)臟器官AMA活性與對(duì)照組相比均有一定程度的下降，其中試驗(yàn)Ⅰ組和田羊脾臟、心臟和肺臟與試驗(yàn)Ⅱ組和田羊心臟、肺臟AMA活性均顯著低于對(duì)照（P<0.05），試驗(yàn)Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟和試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟、腎臟和脾臟AMA活性均極顯著低于對(duì)照（P<0.01）。試驗(yàn)表明，長(zhǎng)時(shí)間、大劑量的攝食小花棘豆可顯著影響和田羊內(nèi)臟器官AMA活性，其中小花棘豆中毒對(duì)肝臟和腎臟的影響最為明顯。

2.4 和田羊小花棘豆中毒對(duì)內(nèi)臟器官AMA1在mRNA表達(dá)水平的影響

由表3可知，試驗(yàn)組和田羊內(nèi)臟器官中AMA1均有表達(dá)。與對(duì)照組相比。試驗(yàn)Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟與試驗(yàn)Ⅱ組和田羊脾臟AMA1mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照（P<0.05）：試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟與腎臟中AMA1mRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照（P<0.01）。其余指標(biāo)均與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，大劑量、長(zhǎng)時(shí)間的飼喂小花棘豆可顯著影響和田羊肝臟、腎臟和脾臟的AMA1在mR-NA的表達(dá)水平。

2.5 和田羊小花棘豆中毒對(duì)內(nèi)臟器官AMA2在mRNA水平表達(dá)的影響

由表4可知，通過(guò)小花棘豆的攻毒飼喂，各試驗(yàn)組和田羊內(nèi)臟器官AMA2mRNA表達(dá)量均有不同程度的下降，其中試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟與腎臟中AMA2mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照（P<0.05），但其余臟器指標(biāo)均與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)表明，小花棘豆中毒對(duì)和田羊內(nèi)臟器官AMA1mRNA表達(dá)量的影響較為顯著，對(duì)AMA2mRNA表達(dá)量的影響不明顯。

2.6 和田羊小花棘豆中毒對(duì)臟器中AMA基因序列的影響

經(jīng)DNAStar軟件分析及NCBIBlast比對(duì)，試驗(yàn)Ⅰ組和田羊肺臟和心臟AMA與公布的基因序列完全一致，脾臟AMA與公布的基因序列重合率大于99%，表明低劑量小花棘豆中毒對(duì)和田羊肺臟、心臟及脾臟AMA的表達(dá)均無(wú)顯著影響。試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟、腎臟AMA與公布的基因序列有較大差異，其中試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組和田羊肝臟AMA1與公布的基因序列重合率分別只有93%和90%，腎臟AMA1與公布的基因序列重合率分別只有93%和91%，但各試驗(yàn)組和田羊AMA2與公布的基因序列重合率均在95%以上，表明小花棘豆中毒對(duì)和田羊內(nèi)臟器官中AMA1有顯著影響。

3 討論

小花棘豆化學(xué)成分組成復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆含有生物堿、皂苷、黃酮、揮發(fā)油、酚類(lèi)、有毒蛋白等多種活性物質(zhì)，其中吲哚里西啶類(lèi)生物堿苦馬豆素被多數(shù)研究者確認(rèn)為小花棘豆的主要毒性成分。目前研究認(rèn)為，苦馬豆素陽(yáng)離子呈半椅狀結(jié)構(gòu)，而甘露糖苷在酶水解的過(guò)程中其陽(yáng)離子也形成了半椅狀的立體構(gòu)型，二者極為類(lèi)似，故苦馬豆素對(duì)AMA具有極高的親和性：另?yè)?jù)化學(xué)分析表明。苦馬豆素的吲哚里西啶環(huán)上結(jié)合有3個(gè)羥基，其中的順式二醇官能團(tuán)和對(duì)位的羥基可增加苦馬豆素同甘露糖陽(yáng)離子的相似性，分子間的氫鍵又增加了苦馬豆素與AMA結(jié)合的特異性，并在其糖基化修飾甘露糖低聚糖的過(guò)程中發(fā)揮作用，造成甘露糖代謝障礙，最終因低聚糖大量蓄積而導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞損傷。賈琦珍等研究表明小花棘豆中毒可導(dǎo)致動(dòng)物臟器損傷，而且肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)與小花棘豆中毒均極顯著相關(guān)（P<0.01）。心臟指數(shù)與肺臟指數(shù)與小花棘豆中毒均顯著相關(guān)（P<0.05）。丁伯良等研究認(rèn)為甘肅棘豆（主要毒性成分為苦馬豆素）中毒山羊組織細(xì)胞的空泡變性與AMA活性下降有關(guān)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMA在和田羊內(nèi)臟器官組織中均有分布，小花棘豆中毒和田羊內(nèi)臟器官中AMA活性顯著下降，而且與時(shí)間一劑量呈正相關(guān)。表明苦馬豆索可通過(guò)影響AMA導(dǎo)致動(dòng)物中毒。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織中存在3種結(jié)構(gòu)形式不同的AMA，其主要在糖基化修飾低聚糖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是N-聚糖成熟和降解的必要酶，也可在N-糖基化過(guò)程中加工甘露糖。不同的AMA可降解各類(lèi)糖蛋白中的低聚糖苷，從而影響蛋白的折疊、成熟等過(guò)程，苦馬豆素與甘露糖競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AMA可導(dǎo)致糖蛋白構(gòu)象及生物活性改變，中毒動(dòng)物出現(xiàn)溶酶體蓄積病的典型癥狀，Douglas等研究發(fā)現(xiàn)苦馬豆素可顯著影響AMA的表達(dá)，并認(rèn)為苦馬豆素對(duì)AMA的抑制不僅是因?yàn)榭臻g結(jié)構(gòu)的相似，還因?yàn)槿鯄A性的苦馬豆素極易與酸性的AMA結(jié)合。賈琦珍等研究表明苦馬豆索可顯著抑制AMA在家兔腦組織中的表達(dá)，長(zhǎng)時(shí)間、高劑量的攝入苦馬豆索可極顯著抑制AMA1在家兔小腦、丘腦和大腦組織中的mRNA表達(dá)量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆毒性成分SW可影響和田羊內(nèi)臟器官中AMA1和AMA2在mRNA水平的表達(dá)，而且其對(duì)AMA1的影響較為顯著。該結(jié)果與榮杰、宋巖巖、張建軍等的研究結(jié)果一致。另外免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒和田羊內(nèi)臟器官中AMA蛋白表達(dá)均有一定程度的下降，而且高劑量小花棘豆攻毒可導(dǎo)致和田羊內(nèi)臟器官AMA蛋白表達(dá)受到顯著抑制。中、高劑量苦馬豆素均可顯著降低中毒綿羊肝臟、腎臟AMA1基因序列與公布的基因序列的重合率，高劑量組攻毒綿羊肝臟AMA1基因序列與NCBI公布的序列重合率僅有90%，表明綿羊小花棘豆中毒可顯著影響AMA1mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平和基因序列組成。

Doudas等研究發(fā)現(xiàn)苦馬豆素是AMA1的高效抑制劑，而且這種抑制作用極為專(zhuān)一：對(duì)AMA2、β-甘露糖苷酶等不能完全抑制。本研究結(jié)果與之一致?？囫R豆素的弱堿性質(zhì)及其空間結(jié)構(gòu)特性，使A-MA1與苦馬豆素極易結(jié)合，導(dǎo)致蛋白合成異常，出現(xiàn)天冬酰胺-糖蛋白聚合體。不同的動(dòng)物、中毒組織及攻毒植物可導(dǎo)致不同的低聚糖組成，中毒綿羊的肝、腎組織中低聚糖主要為甘露糖-葡萄糖-N-乙?；咸烟?，中毒動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)大量蓄積低聚糖可造成組織、器官等損傷及發(fā)生功能性障礙。其中神經(jīng)系統(tǒng)損害出現(xiàn)最早，其損傷為不可逆并多伴有神經(jīng)細(xì)胞損傷：生殖系統(tǒng)損傷出現(xiàn)較晚。但影響最為廣泛，并可透過(guò)胎盤(pán)屏障影響胎兒健康，肝臟是動(dòng)物最重要的解毒器官，腎臟是動(dòng)物重要的排泄器官。但苦馬豆素對(duì)動(dòng)物肝臟、腎臟影響的微觀機(jī)制研究較少。本試驗(yàn)研究了苦馬豆素對(duì)綿羊肝臟、腎臟AMA活性、mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平和基因序列組成的影響，為動(dòng)物小花棘豆中毒機(jī)制的研究提供了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

小花棘豆中毒可導(dǎo)致和田羊內(nèi)臟器官AMA活性與表達(dá)水平顯著下降，而且下降趨勢(shì)與小花棘豆攝入量呈顯著正相關(guān)。小花棘豆中毒對(duì)肝臟、腎臟AMA1的影響較為顯著，其可通過(guò)mRNA水平和蛋白表達(dá)水平影響AMA1在肝臟和腎臟中的作用。