張宇　潘敏　李曉娜　王萌　楊葉　朱朝華　鄭服叢

摘 要 草甘膦除草劑的靶標酶為5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。為研究HbEPSPS基因在橡膠樹中的逆境響應(yīng)功能，分析其在草甘膦、機械傷害、白粉菌侵染和不同激素處理下的表達模式。結(jié)果表明：草甘膦、機械傷害和IAA處理誘導(dǎo)HbEPSPS顯著上調(diào)；干旱、ABA、SA和ETH處理亦能誘導(dǎo)HbEPSPS顯著上調(diào)；H2O2處理橡膠樹葉片中HbEPSPS表達呈現(xiàn)雙峰規(guī)律；白粉菌侵染葉片，HbEPSPS表達顯著下調(diào)。不同部位表達分析結(jié)果表明，HbEPSPS基因在花中表達量最高，其次是樹皮和葉，在膠乳中表達量最低。此結(jié)果表明，HbEPSPS基因在橡膠樹草甘膦藥害和激素信號響應(yīng)中具有重要作用，為研究其在橡膠樹抗逆機制中的作用奠定良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；草甘膦 ；HbEPSPS ；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.09.008

Abstract The target enzyme of herbicide Glyphosate is 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase （EPSPS）. In order to study the function of HbEPSPS in stress response of rubber tree， we analyzed HbEPSPS expression patterns in rubber tree treated with glyphosate， mechanical wounding， powdery mildew infection and different hormones. Results show that glyphosate， mechanical wounding and IAA treatment induced significant upregulation of HbEPSPS； drought， ABA， SA and ETH treatment also upregulated HbEPSPS expression obviously. In rubber tree leaves treated with H2O2， HbEPSPS expression showed a bimodal pattern. Rubber tree leaves infected with powdery mildew had a significant downregulation of HbEPSPS expression. Expression analysis in different parts of rubber tree showed that HbEPSPS was most highly expressed in flower， followed by the bark and leaves， the lowest in latex. This study indicates that HbEPSPS plays an important role in the response to glyphosate phytotoxicity and hormone signal， which lay a good foundation for further study of the stress resistance mechanism in rubber tree.

Keywords Hevea brasiliensis ； glyphosate ； HbEPSPS ； expression analysis

5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase， EPSPS）催化莽草酸-3-磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（EPSP）[1]。草甘膦（Glyphosate）除草劑抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、生長素等的前體、黃酮、質(zhì)體醌及酚類和生物堿的次生代謝途徑[2]。目前，已在擬南芥[3]、煙草[4]、棉花[5]、油菜[6]及大豆[7]等物種中克隆了EPSPS基因，并做了相關(guān)的基因功能研究。已有研究結(jié)果表明，在草甘膦脅迫下植物通過提高部分EPSPS基因的表達量來降低藥害[8]。EPSPS基因在植物不同組織和不同激素處理下表達有顯著差異[9-10]。在外界脅迫條件下，植物抗逆性相關(guān)物質(zhì)如黃酮、木質(zhì)素和生物堿等在植株中大量積累[11]。但目前關(guān)于橡膠樹EPSPS基因在不同環(huán)境脅迫方面研究較少。

橡膠樹是中國的經(jīng)濟作物之一，其在生長過程中容易受到外界環(huán)境的影響，如在干旱時發(fā)生病蟲害，降低膠乳產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致其死亡[12]；白粉病侵染使橡膠樹葉片脫落，生長受抑制[13]；外源茉莉酸（JA）能夠誘導(dǎo)乳管分化和乳汁的生物合成[14-15]；乙烯利刺激橡膠樹增產(chǎn)[16]。筆者已經(jīng)證明，草甘膦誘導(dǎo)橡膠樹葉片畸形[17]。本研究以橡膠樹品種CATAS7-33-97為材料，采用qPCR方法分析已克隆巴西橡膠樹EPSPS基因（登錄號：JQ914660.1）在不同組織、不同激素處理、干旱、傷害和白粉菌處理條件下的表達情況，為進一步解析橡膠樹HbEPSPS基因結(jié)構(gòu)和草甘膦抗性等逆境響應(yīng)機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品種熱研7-33-97芽接苗、成齡開割樹和GT1種子的實生苗為材料，芽接苗和實生苗種植于海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院（儋州校區(qū)）實驗基地（草炭土與粘土體積比為3∶1的育苗袋中）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

根據(jù)天根多糖多酚植物總RNA試劑盒說明書提取各處理樣品的RNA，分別用超微量核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度、純度和1%甲醛變性膠電泳檢測RNA的完整性，再用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄[18]。

1.2.2 HbEPSPS基因的表達分析

（1）選取均勻一致且穩(wěn)定期的芽接苗，采用有效成分含量為41%的草甘膦異丙胺鹽水劑稀釋2 400倍處理，分別采集未噴藥前葉片、噴藥前半黃半綠葉片、小于7 cm畸形葉、大于7 cm畸形葉和新生的恢復(fù)葉。

（2）干旱處理采用CATAS7-33-97芽接苗為材料，斷水10 d，分別采取葉子樣品，對照保持水分[19]。

（3）機械傷害采用鑷子夾傷葉片，在0、0.5、1、2、6和12 h采取葉片樣品，以未處理的植株作為對照。

（4）激素處理采用CATAS7-33-97芽接苗為材料，分別是200 μmol/L脫落酸（ABA）、100 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、3 mmol/L赤霉素（GA3）、5 mmol/L水楊酸（SA）、1.0%乙烯利（ETH）、200 mmol/L茉莉酸（JA）和2%過氧化氫（H2O2），分別在0、0.5、2、6、10、24、48和72 h采取葉片樣品，所有藥劑用0.05%乙醇進行溶解，對照植株噴施0.05%乙醇水溶液[20]。

（5）白粉菌處理以巴西橡膠樹GT1種子的實生苗為材料，進行白粉菌侵染，然后分別采集0、1、3、5和7級葉片；同時采集15年生的成齡開割樹CATAS7-33-97的葉片、膠乳、花和樹皮樣品[21]。

以HbACTIN為內(nèi)參基因，設(shè)計熒光定量引物NEPSPSF（5'-GAGTCACCATAGAACACAGT-3'）和HbEPSPS（5'-CCAGCGTCATAGCAACAT-3'），分析HbEPSPS基因的表達量。

1.2.3 統(tǒng)計分析

實驗測定為3次重復(fù)，采用SAS9.1.3軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較分析，采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用origin 2015軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦處理后橡膠樹中HbEPSPS的表達分析

從圖1可知，草甘膦處理橡膠樹芽接苗后，葉片呈現(xiàn)半黃半綠、畸形葉片等表型，葉片處于半黃半綠時，HbEPSPS的表達量顯著提高，是對照的2.5倍，而畸形葉、恢復(fù)葉與對照無顯著差異。

2.2 機械傷害下HbEPSPS的表達分析

由圖2可以看出，機械傷害處理0.5 h時，HbEPSPS基因的表達量達到最高峰，是對照的1.8倍。隨著處理時間的延長，該基因的表達量顯著下調(diào)，至處理12 h時表達量達到最低點。說明HbEPSPS基因可能參與了橡膠樹機械傷害的早期脅迫響應(yīng)機制。

2.3 干旱脅迫條件下HbEPSPS的表達分析

由圖3可知，干旱處理橡膠樹芽接苗9 d時，HbEPSPS基因的表達量顯著上調(diào)并達到最高值，是處理前的3.4倍，隨后表達量有所下降，但變化不顯著。從圖3中不斷變化的HbEPSPS基因表達情況可看出，該基因參與橡膠樹干旱脅迫響應(yīng)過程。

2.4 白粉菌侵染下HbEPSPS的表達分析

由圖4可以看出，相對于未處理時，橡膠樹葉片中HbEPSPS基因的表達水平在白粉菌侵染作用下顯著下調(diào)。隨著病害程度的加重，HbEPSPS基因的表達量先顯著上升，再顯著下降，最后又顯著上升，但表達量始終低于處理前。

2.5 不同組織中HbEPSPS的表達分析

從圖5可以看出，HbEPSPS基因在所有組織中顯著表達，其中在花中表達量最高，是膠乳的4倍，其次是樹皮和葉，在膠乳中表達量最低。

2.6 不同激素和H2O2處理下HbEPSPS的表達分析

由圖6可以看出，ABA處理橡膠樹葉片后，HbEPSPS基因的表達量在處理的48 h內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢，在處理后48 h達最高值，相當于對照的2.4倍。在SA處理作用下，HbEPSPS基因表達量持續(xù)上升，在處理后72 h達最高峰，是對照的2.5倍。ETH處理后24 h內(nèi)，HbEPSPS基因的表達量較對照顯著下調(diào)，48 h時其表達量顯著上調(diào)，達到最大值，是對照的2.5倍。JA處理下，HbEPSPS基因表達量差異顯著，在0.5 h時表達量達最高，隨后該基因的表達量顯著下降，至24 h達到最低值。IAA處理橡膠樹葉片后，HbEPSPS基因表達量在處理后2 h達最高值，是對照的25倍，隨后顯著下降，隨著時間的延長，該基因的表達量無顯著性變化。在H2O2處理的橡膠樹葉片中，HbEPSPS基因表達量在0.5 h 顯著上調(diào)，但隨后便顯著下降。在處理后10 h再次顯著上升，達到表達最高值，是對照的15倍。由此可知，ABA、SA、ETH、JA和IAA均能誘導(dǎo)橡膠樹葉片中HbEPSPS基因的表達量發(fā)生變化。推測橡膠樹HbEPSPS基因可能參與橡膠樹不同的激素信號傳導(dǎo)途徑。

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于EPSPS基因的研究大部分集中在草本植物抗除草劑機制的領(lǐng)域[3-7]。有研究者發(fā)現(xiàn)，在草甘膦脅迫下，植物為適應(yīng)正常芳香族氨基酸的合成，EPSPS基因的表達量會增加，并通過此原理獲得了抗草甘膦細胞株[22]。在橡膠樹中，HbEPSPS基因在草甘膦處理后葉片處于半黃半綠時表達量顯著升高，其他不同葉片狀態(tài)下表達量較對照無差異，與草甘膦促使銀杏中EPSPS基因表達量的升高一致[10]。

激素和各種環(huán)境脅迫能夠誘導(dǎo)EPSPS基因的表達量升高，如在矮牽牛中，紫外光、低溫和激素均能使誘導(dǎo)EPSPS表達的轉(zhuǎn)錄因子ZPT2-2在花器官中表達量升高[23-24]。還有研究結(jié)果表明，外界的環(huán)境壓力能夠在莽草酸途徑下合成黃酮類等前體物質(zhì)[25]。本研究中，機械傷害和IAA處理前期能誘導(dǎo)HbEPSPS基因表達在橡膠樹上顯著上調(diào)；在干旱、ABA、SA和ETH處理后期能誘導(dǎo)HbEPSPS基因表達顯著上調(diào)；H2O2處理時，HbEPSPS基因表達量既在處理前期又在處理后期顯著表達；白粉菌侵染橡膠樹葉片下，HbEPSPS基因表達量較對照顯著下調(diào)。因此，橡膠樹葉片中HbEPSPS基因在環(huán)境壓力下表達量受影響可能與芳香族氨基酸途徑有關(guān)，說明HbEPSPS基因能夠迅速應(yīng)答外界環(huán)境脅迫，起到調(diào)控作用。

HbEPSPS基因在橡膠樹花中表達量最高，其次是樹皮和葉，在膠乳中表達量最低，這一結(jié)果與矮牽牛中EPSPS基因在花瓣中的表達量最高一致[26-27]。但在木本植物喜樹中，EPSPS基因在葉中表達量最高，與本實驗結(jié)果不一致[28]。出現(xiàn)這種表達差異的原因可能是由于EPSP基因在不同的組織中發(fā)生轉(zhuǎn)錄的起始位點不同。

因此，了解HbEPSPS基因的結(jié)構(gòu)及逆境響應(yīng)機制，將為橡膠樹抗除草劑、抗逆機理及橡膠樹抗性品種培育提供理論依據(jù)。

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