趙　娜, 賀恒鵬, 周　霞

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 遼寧 沈陽, 110032)

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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感性的研究

趙娜, 賀恒鵬, 周霞

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 遼寧 沈陽, 110032)

摘要:目的探討耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)對萬古霉素的敏感性。方法取2007—2014年醫(yī)院分離的MRSA102株，采用瓊脂稀釋法檢測萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度(MIC)，采用PCR方法進(jìn)行SCCmec分型及相關(guān)基因檢測。結(jié)果2007—2014年萬古霉素對MRSA的MIC(90)分別為1、1、2、2、2、2、2、2 mg/L, MIC(50)分別為1、1、1、2、1、1、1、1 mg/L。SCCmecⅡ型的MIC(50)和MIC(90)都為2 mg/L, SCCmecⅢ型的MIC(50)和MIC(90)分別為1 mg/L和2 mg/L, SCCmec V型和Ⅳ型的MIC(50)和MIC(90)都為1 mg/L。結(jié)論2007—2014年萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度無顯著變化, SCCmecⅡ型和Ⅲ型MRSA對萬古霉素的敏感性低于SCCmec V型和Ⅳ型菌株。

關(guān)鍵詞:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌; 萬古霉素; 敏感性

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是金黃色葡萄球菌的一種，也是革蘭陽性球菌，是1961年英國學(xué)者Jevons發(fā)現(xiàn)的一種新型的耐青霉素酶的耐藥菌株[1]。MRSA的耐藥基因主要位于葡萄球菌盒式染色體mec(SCCmec)上，根據(jù)mecA基因組分的差異，大致將SCCmec分成5種不同的類型(I～V型)[2]。近年來，MRSA在金黃色葡萄球菌感染中所占的比例逐年提高，感染程度越來越嚴(yán)重，已成為醫(yī)院及社區(qū)感染的重要病原菌之一[3]。Boucher等[4]研究顯示，美國MRSA感染每年造成約19 000人死亡，MRSA 感染已經(jīng)與乙型肝炎、AIDS同為世界3大感染性疾病[5]。本研究探討MRSA對萬古霉素的敏感性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

2007—2014年醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的102株MRSA菌株。購于中國藥品生物制品檢定所的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213。由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)的萬古霉素藥粉，有效期內(nèi)使用。賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司生產(chǎn)的BHI干粉培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1萬古霉素選擇性培養(yǎng)基的配制：稱取47 g BHI瓊脂，溶解于900 mL蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌，冷卻至45～50 ℃，在每個(gè)平皿中加入2 mL 2.5 mg/L萬古霉素溶液，再倒入約18 mL的瓊脂溶液充分混勻，即配制成0.25 mg/L的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基。同法，分別加入不同濃度的萬古霉素即可配制成0.5、1、2、4和8 mg/L的萬古霉素培養(yǎng)基。待瓊脂凝固后立即裝入密閉塑料袋中，放入2～8 ℃冰箱保存，5 d內(nèi)使用。

1.2.2MRSA的最低抑菌濃度的檢測：將MRSA凍存菌株接種于血平板復(fù)活，并轉(zhuǎn)種2代，然后用無菌生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)瞎?細(xì)菌濃度相當(dāng)于108CFU/mL)，稀釋至107CFU/mL, 取1 μL分別接種于0.25、0.5、1、2、4和8 mg/L的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基，35℃孵育，觀察細(xì)菌生長情況，以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)，抑制50%試驗(yàn)菌的最低藥物濃度為MIC50，抑制90%試驗(yàn)菌的最低藥物濃度為MIC90。同時(shí)參照CLSI-M100-S19-2009用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213作為質(zhì)量控制(MIC參考范圍為0.5～2 mg/L)。

1.2.3PCR方法進(jìn)行SCCmec分型及相關(guān)基因檢測: ① PCR模板。采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，嚴(yán)格按照操作說明提取基因組DNA。② PCR引物 由上海生工合成。③ PCR體系。上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mM) 2 μL，MgCl2(25 mM)1 μL，10X Buffer 2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，無菌純水加至25 μL。④ PCR循環(huán)參數(shù)。94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min、50℃ 2 min、72℃ 2 min，循環(huán)35次，最后72 ℃延長10 min。⑤ PCR產(chǎn)物電泳。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察是否出現(xiàn)目的條帶，并拍照成像。⑥ PCR產(chǎn)物測序。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司純化并進(jìn)行雙向測序。⑦ 序列分析。測序結(jié)果經(jīng)bioedit軟件處理后，提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST對比，明確其基因型。見表1。

表1　SCCmec分型及相關(guān)基因檢測

2結(jié)果

2.12007—2014年MRSA對萬古霉素的敏感性

標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213的MIC檢測結(jié)果為1 mg/L, 在參考范圍內(nèi)。2007—2014年的萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度分布情況見表2。2007、2008年的MIC90為1 mg/L, 對萬古霉素的敏感性較高；2009—2014年MIC90上升為2 mg/L, 較2007、2008年升高；而MIC50值在8年中只有2010年稍微波動(dòng)，其值為2 mg/L, 其余年份為1 mg/L, 可知2010年MRSA對萬古霉素敏感性較低。

2.2不同MecA基因型的MRSA對萬古霉素敏感情況

萬古霉素對各種基因型的MRSA的的最低抑菌濃度見表3。結(jié)果顯示CCmecⅡ型、Ⅲ型的MIC90均為2 mg/L，SCCmecV型和Ⅳ型的MIC90均為1 mg/L, SCCmecⅡ型、Ⅲ型的MRSA對萬古霉素敏感性低于SCCmecV型和Ⅳ型；只有SCCmecⅡ型MIC50為2 mg/L, 其余各型均為1 mg/L, SCCmecⅡ型的MRSA對萬古霉素敏感性最低。

表3　萬古霉素對Ⅱ型，Ⅲ型，Ⅳ型，V型MRSA的

3討論

MRSA感染的治療是目前臨床難題之一，其與很多難治性感染有關(guān)[6]，且MRSA所致感染發(fā)生率呈明顯上升趨勢，已成為醫(yī)院相關(guān)性感染的重要致病菌[7]。MRSA的基因分型中，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型常攜帶多個(gè)耐藥基因(臨床表現(xiàn)對多種抗菌藥物耐藥)，多存在于醫(yī)院環(huán)境中；SCCmec Ⅳ、Ⅴ型體積較小，幾乎不攜帶其他耐藥基因(對大多抗菌藥物敏感)，且適應(yīng)性強(qiáng)，易于在人群中傳播和定植，多見于社區(qū)環(huán)境，已成為社區(qū)獲得性MRSA的獨(dú)特標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中，SCCmecⅡ型的MIC50、MIC90都為2 mg/L，SCCmecⅢ型的MIC50和MIC90分別為1 mg/L和2 mg/L, SCCmec V型和Ⅳ型的MIC50、MIC90都為1 mg/L。結(jié)果表明醫(yī)院獲得性的MRSA對萬古霉素的敏感性低于社區(qū)獲得性的MRSA，這可能與其攜帶多種毒素、毒力很強(qiáng)且適應(yīng)性強(qiáng)有關(guān)。Moise-Broder等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型MRSA易引起萬古霉素治療的失敗，本實(shí)驗(yàn)中SCCmecⅡ型MRSA對萬古霉素敏感性也是最低的，與上述研究相符。

研究[9]發(fā)現(xiàn)萬古霉素對MRSA的最低抑菌濃度逐漸增高，而本實(shí)驗(yàn)中MRSA對萬古霉素的敏感性逐年降低的趨勢不甚明顯，這可能與地區(qū)差異以及不同年份使用抗生素的情況有關(guān)。很多國外的研究都檢測出萬古霉素中介金黃色葡萄球菌以及耐萬古霉素金黃色葡萄球菌。因此，定期檢測MRSA，合理使用抗生素，對減緩耐萬古霉素MRSA出現(xiàn)具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1]葛美層. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥菌株的檢出現(xiàn)狀與分析[J]. 中外醫(yī)療, 2014(4): 189.

[2]ZHANG K, MCCLURE J A, ELSAYED S, et al. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(10): 5026.

[3]許文, 楊聯(lián)云. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行病學(xué)和耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2013, 10 (1): 75.

[4]BOUCHER HW, COREY GR. Epidemiology of methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. Clinical Infectious Diseases, 2008, 46 ( Suppl5): S344.

[5]陳迎曉, 黃瑜, 王曉東, 等. 醫(yī)院與社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的臨床特點(diǎn)和耐藥性的對比分析[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2013, 16 (1A): 93.

[6]程麗娟, 李曉燕. 金黃色葡萄球菌89株耐藥性分析[J]. 山西醫(yī)藥雜志, 2013, 42(2): 210.

[7]石峰, 吳田珠, 肖宇, 等. 不同劑量萬古霉素治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌所致腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的效果研究[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志, 2014, 22(10): 125.

[8]VANDENESCH F, NAIMI T, ENRIGHT M C, et al. Community-acquired methicillin-resistant staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(8): 978.

[9]MURRAY K P, ZHAO J J, DAVIS S L, 等. 治療萬古霉素最低抑菌濃度>1mg/L耐甲氧西林金黃色葡萄球菌血流感染早期改用達(dá)托霉素的配對隊(duì)列研究[J]. 中國感染與化療雜志, 2014, 14(6): 556.

Research on sensibility of meticillin-resistant staphylococcus aureus to vancomycin

ZHAO Na, HE Hengpeng, ZHOU Xia

(DepartmentofLaboratory,TheFourthAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang,Liaoning, 110032)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the sensibility of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) to vancomycin. MethodsA total of 102 MRSA strains in hospital from 2007 to 2014 were collected. Agar dilution method was used to detect the minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin to MRSA, and PCR was used to detect SCCmec classification and related gene. ResultsFrom 2007 to 2014, the values of MIC(90) of vancomycin to MRSA were 1, 1, 2, 2, 2, 2, 2 and 2 mg/L respectively, and the values of MIC(50) were 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1 and 1 mg/L respectively. Both MIC(90) and MIC(50 ) of SCCmec Ⅱ were 2 mg/L, MIC(90) and MIC(50 ) of SCCmec Ⅲ were 2 mg/L and 1 mg/L respectively, and MIC(90) and MIC(50 )of SCCmec Ⅳ and V were 1 mg/L. ConclusionThe MIC of vancomycin to MRSA in hospital dose not change obviously from 2007 to 2014. The sensibility of SCCmec Ⅱand SCCmec Ⅲ to vancomycin is lower than SCCmec Ⅳ and SCCmec V.

KEYWORDS:methicillin-resistant staphylococcus aureus; vancomycin; sensibility

中圖分類號:R 37

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-079-03

DOI:10.7619/jcmp.201607023

收稿日期:2015-11-20