謝映紅, 王　巍

(解放軍第202醫(yī)院, 1. 綜合科; 2. 內(nèi)分泌科, 遼寧 沈陽, 110003)

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缺血預處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷AMPK通路的影響

謝映紅1, 王巍2

(解放軍第202醫(yī)院, 1. 綜合科; 2. 內(nèi)分泌科, 遼寧 沈陽, 110003)

摘要:目的探討缺血預處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法24只SD大鼠隨機分為4組，即糖尿病缺血再灌注組(DMI/R組)、非糖尿病缺血再灌注組(NDMI/R組)、糖尿病缺血預處理組(DMIPC組)及非糖尿病缺血預處理組(NDMIPC組)。應用2%鏈脲佐菌素腹腔注射方法建立糖尿病大鼠模型，造模后第10周建立離體心臟灌注模型。檢測各組大鼠復灌后冠脈流出液肌酸激酶含量、心肌含水率變化及心排血量、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率的恢復率，并利用Western blot方法檢測心肌組織腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及磷酸化AMPK蛋白表達水平。結(jié)果糖尿病大鼠復灌后冠脈肌酸激酶含量及心肌含水率顯著高于非糖尿病組大鼠(P<0.05)，左室功能恢復率顯著低于非糖尿病組(P<0.05)，AMPK及磷酸化AMPK表達水平均顯著低于非糖尿病組(P<0.05)。糖尿病大鼠缺血預處理組與缺血再灌注組上述各指標比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論心肌缺血預處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用不明顯，可能與糖尿病大鼠心肌AMPK信號通路受抑有關(guān)。

關(guān)鍵詞:缺血預處理; 糖尿病; 心肌缺血再灌注損傷; 腺苷酸活化蛋白激酶

心血管事件是造成糖尿病患者死亡的主要原因，其中缺血性心臟病的發(fā)病率、致死率呈逐年上升趨勢[1]。心肌缺血、氧供減少可造成心肌損傷，及時恢復血流灌注可對抗缺血所造成的損傷，但血流恢復灌注過程常常會加重心肌損傷，即出現(xiàn)“心肌缺血再灌注損傷(MI/R)”。心肌缺血預處理(MIPC)是一種有效的內(nèi)源性心肌保護措施，可對抗心肌缺血再灌注損傷。本研究構(gòu)建了糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察缺血預處理對大鼠冠脈流出液肌酸激酶含量、心肌含水量、左室功能恢復率及心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK表達水平的影響，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性SD大鼠24只(購于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗中心)，體質(zhì)量220～320 g。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為糖尿病組及非糖尿病組，每組12只。糖尿病組大鼠于造模前夜禁食，次日晨起按35 mg/kg腹腔注射2%鏈脲佐菌素(STZ)枸櫞酸緩沖液；非糖尿病組大鼠注射等量生理鹽水。72 h后通過大鼠尾靜脈采血測定血糖，血糖>16.65 mmol/L者視為糖尿病造模成功。所有動物自由攝食、飲水。

1.2材料

AMPK、p-AMPK一抗購自美國Santa cruz公司；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；肌酸激酶檢測試劑盒購自Beackman公司。心功能檢測采用B10PAC16生理記錄儀(CB I-800Q USA)，血糖儀(Accu-DHEK)及試紙條由德國羅氏公司提供。

1.3方法

1.3.1制備Langendorff離體心臟灌流模型：腹腔注射戊巴比妥5 mg/kg麻醉各組大鼠，開胸前5 min腹腔注射肝素500 U/kg, 開胸后迅速取出心臟，置于4 ℃改良Krebs-Henseleit (K-H, 1 mmol/L: 氯化鈉118.0 mmol/L、氯化鉀14.7 mmol/L、磷酸鉀1.2 mmol/L、硫酸鎂1.2 mmol/L、碳酸氫鈉25.0 mmol/L、氯化鈣1.25 mmol/L、葡萄糖10.0 mmol/L, pH 7.3～7.4)液中，并插入主動脈插管連接到Langendorff灌注裝置上。經(jīng)主動脈灌注38 ℃經(jīng)95% O2和5% CO2混合氣體飽和的K-H液(灌注壓為80 cmH2O), 缺血期間關(guān)閉氣體。

1.3.2糖尿病缺血再灌注模型構(gòu)建：將已構(gòu)建好的糖尿病組大鼠(12只)再隨機分成2組，每組6只，即糖尿病缺血再灌注組(DMI/R組)及糖尿病缺血預處理組(DMIPC組)；同樣，非糖尿病組大鼠(12只)也隨機分成2組，每組6只，即非糖尿病缺血再灌注組(NDMI/R組)及非糖尿病缺血預處理組(NDMIPC組)。DMI/R及NDMI/R組：將心臟平衡灌流30 min后，缺血30 min，再復灌30 min。DMIPC及NDMIPC組：心臟平衡灌流10 min，缺血5 min, 再灌注5 min，連續(xù)3個循環(huán)后缺血30 min, 再復灌30 min。

1.3.3指標測定: ① 冠脈流出液CK含量測定。取復灌30 min后的冠脈流出液，12 h內(nèi)用全自動生化分析儀測定CK含量，按試劑盒說明操作。② 心肌組織AMPK、p-AMPK蛋白表達測定。采用Western blot法，取100 mg組織均漿，加入裂解液，離心后取上清，用BCA法測定蛋白濃度。各樣品取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，封閉。加入一抗(AMPK、p-AMPK 1︰2 000稀釋)孵育，二抗(HPR-標記的羊抗兔IgG)室溫孵育。特異性反應條帶經(jīng)AP顯色后，采用自動電泳凝膠成像分析儀分析，計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值，即為AMPK蛋白表達的相對強度。③ 心肌含水率測定。實驗結(jié)束后，各組大鼠取左室心肌組織，拭干，稱濕重，然后置于電烤箱內(nèi)，60 ℃烘干24 h后取出測干重。心肌含水率(%)=(濕重-干重)×100%。④ 左心功能恢復率測定。按文獻[2]操作方法，在缺血前及復灌30 min后分別測定各組大鼠心排血量(CO)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)數(shù)值并進行前后比較，所得結(jié)果即反映左心功能恢復率。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析(One-way Anova)，組間兩兩比較采用LSD方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

與非糖尿病組比較，糖尿病組各組大鼠血糖顯著升高(P<0.05)，糖尿病各組大鼠血糖比較無顯著差異(P>0.05)。非糖尿病大鼠中，缺血預處理組冠脈流出液CK含量較缺血再灌注組顯著下降(P<0.05)。與非糖尿病組大鼠比較，糖尿病組大鼠CK含量顯著升高(P<0.05)；糖尿病大鼠中，缺血預處理組與缺血預適應組比較無顯著差異(P>0.05)。非糖尿病大鼠中，缺血預處理組大鼠心肌含水率顯著低于缺血再灌注組大鼠(P<0.05)。與非糖尿病大鼠相比，糖尿病各組大鼠心肌含水率顯著偏高(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血預處理組與缺血再灌注損傷組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血糖、冠脈流出液CK水平及心肌細胞含水率比較

與NDMI/R組比較, *P<0.05; 與NDMIPC組比較, #P<0.05。

非糖尿病大鼠中，復灌后缺血預處理組心排血量(CO)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)恢復率顯著高于缺血再灌注組(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血預處理組與缺血再灌注組比較，上述指標無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　復灌后各組大鼠左心功能恢復率比較　%

與NDMI/R組比較, *P<0.05; 與NDMIPC組比較. #P<0.05。

非糖尿病大鼠中，缺血預處理組心肌AMPK、p-AMPK表達顯著強于心肌再灌注損傷組(P<0.05)。糖尿病與非糖尿病各組比較，大鼠心肌AMPK、p-AMPK表達顯著下降(P<0.05)。糖尿病大鼠中，缺血再灌注組與缺血預處理組比較，上述蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

1.NDMI/R組;2.NDMIPC組;3.DMI/R組;4.DMIPC組圖1 各組大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白表達水平

3討論

Murry等[3]于20世紀80年代觀察到一次或反復數(shù)次短暫缺血可使心肌在隨后長時間缺血中得到保護，可提高心肌對缺血的耐受性，并首次提出缺血預處理(IPC)概念。目前，對心肌缺血再灌注損傷(MI/R)及缺血預處理的研究頗多，諸多研究均證實IPC對心肌損傷有確切的保護作用。高血糖是缺血性心臟病發(fā)生的高危因素，糖尿病患者是心梗等心血管事件的高發(fā)人群。目前關(guān)于糖尿病患者對MI/R的耐受性及IPC對其保護作用的研究結(jié)論尚不一致。有學者[4]提出糖尿病對MI/R的耐受性優(yōu)于非糖尿病患者，亦有學者[5]認為糖尿病狀態(tài)可加重MI/R的心肌損傷，并減弱缺血預處理的心肌保護作用。

AMPK被稱為真核細胞的能量感受器，可以調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝。AMPK具有廣泛的下游底物，除與能量合成、消耗有關(guān)，亦可抑制炎癥反應，減輕氧化應激損傷。AMPK信號通路受損與糖尿病、肥胖、心血管等疾病密切相關(guān)，在疾病之間形成內(nèi)在聯(lián)系。心肌缺血時，心肌組織AMP濃度增加、AMP/ATP比值增高可激活AMPK，使AMPK α亞單位上的172位蘇氨酸發(fā)生磷酸化，繼而激活下游信號分子引起生物學效應。心肌缺血再灌注過程中存在能量代謝異常，AMPK的激活可通過促進葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLU-4)從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜增加心肌對葡萄糖的攝取、利用，改善能量供應[6]。AMPK還可以通過抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的活性降低丙二醛輔酶A濃度，激活肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)，促進脂肪酸進入線粒體氧化，釋放ATP供能[7]。除調(diào)節(jié)能量代謝外，AMPK與氧化應激及炎癥反應密切相關(guān)。上述因素亦參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，非糖尿病大鼠中缺血預處理對心肌缺血再灌注損傷有確切的保護作用。在缺血預處理組中，AMPK及磷酸化AMPK表達水平明顯升高，說明AMPK及其信號通路可能參與了缺血預處理對心肌的保護作用[8-9]。糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷較非糖尿病大鼠嚴重，表現(xiàn)在心肌含水率高、復灌后肌酸激酶水平偏高及左室功能恢復率降低[10-11]。而缺血預處理對上述指標無顯著影響，提示缺血預處理對糖尿病大鼠心肌無確切的保護作用。糖尿病屬于代謝性疾病，存在糖、脂等物質(zhì)代謝異常。有研究[12]表明，糖尿病存在AMPK及其信號通路相關(guān)分子表達減少，對其各靶點的調(diào)節(jié)可能成為治療糖尿病的新途徑，但對糖尿病大鼠心肌缺血預處理過程AMPK通路相關(guān)分子的變化缺少研究。本研究顯示，糖尿病組大鼠缺血預處理后AMPK及磷酸化AMPK表達減少，分析缺血預處理對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷幾乎無保護作用，可能與其表達減少有關(guān)。

總之，心肌缺血再灌注過程存在AMPK及磷酸化AMPK表達減少，心肌缺血預處理可激活AMPK，促進AMPK磷酸化，發(fā)揮保護心肌的作用。糖尿病大鼠存在AMPK表達減少，并可能是導致缺血預處理對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷無保護作用的因素之一。

參考文獻

[1]Murase T, Okubo M, Amemiya-Kudo M, et al. Impact of elevated serum lipoprotein (α) concentrations on the risk of coronary heart disease in patients with type 2 diabetes mellitus [J]. Metabolism, 2008, 57(6): 791.

[2]韓勁松, 閻德民, 朱洪玉, 等. 糖尿病對大鼠心肌缺血預處理保護作用的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2008, 33(10): 1195.

[3]Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium [J]. Circulation, 1986, 74(5): 1124.

[4]Chu L M1, Osipov R M, Robich M P, et al. Is hyperglycemia bad for the heart during acute ischemia？[J]. Thorac Cardiovasc Surg, 2010, 140(6): 1345.

[5]Przyklenk K, Maynard M, Greiner DL, et al. Cardioprotection with postconditioning: loss of efficacy in murine models of type-2 and type-1 diabetes[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(5): 781.

[6]Kim N, Kim H M, Lee E S, et al. Dibenzoylmethane exerts metabolic activity through regulation of AMP-activated protein kinase (AMPK)-mediated glucose uptake and adipogenesis pathways[J]. PLoS One, 2015 Mar 10: 10(3): e0120104.

[7]Rai Ajit K. Srivastava, Stephen L. Pinkosky, Sergey Filippov, et al. AMP-activated protein kinase: an emerging drug target to regulate imbalances in lipid and carbohydrate metabolism to treat cardiometabolic diseases[J]. Lipid Res, 2012, 53(12): 2490.

[8]隋春華, 郭郁郁, 翟華玲, 等. 胰高糖素樣肽-1類似物對2型糖尿病 大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志, 2014, 18(1): 9.

[9]閆慶凱, 鄧宜鸝, 方慧, 等. 2型糖尿病合并冠心病患者血清γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶與冠脈病變嚴重程度的相關(guān)性[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2014, 36(15): 1610.

[10]杜宋耿, 陳德俊, 陳尊發(fā), 等. 老年高血壓伴糖尿病患者血管功能狀態(tài)及RAAS指標的變化[J]. 海南醫(yī)學院學報, 2015, 21(9): 1207.

[11]王紅, 龔平. 阿托伐他汀聯(lián)合拜阿司匹林對糖尿病患者炎癥因子、血管內(nèi)皮功能及心 血管事件的影響[J]. 海南醫(yī)學院學報, 2016, 22(5): 441.

[12]Viollet B, Lantier L, Devin-Leclerc J, et al. Targeting the AMPK pathway for the treatment of Type 2 diabetes[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2009, 14(1): 3380.

Effect of ischemic preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury and AMPK signal pathway in diabetic rats

XIE Yinghong1, WANG Wei2

(1.ComprehensiveDepartment; 2.DepartmentofEndocrinology,The202ndHospitalofPeople′sLiberationArmy,Shenyang,Liaoning, 110003)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of myocardial ischemic preconditioning (MIPC) on myocardial ischemia reperfusion injury (MI/R) in diabetic rats. MethodsA total of 24 SD rats were divided into diabetic rats with myocardial ischemia reperfusion injury group (DMI/R group), diabetic rats with ischemic preconditioning group (DMIPC group), non-diabetic rats with myocardial ischemia reperfusion injury group (NDMI/R group) and non-diabetic rats with ischemic preconditioning group (NDMIPC group). 2% streptozotocin was used to induce diabetes mellitus in rats. The isolated heart perfusion Langendorff models were established at tenth week. Creatine kinase content of coronary outflow fluid and myocardial water content were measured. The cardiac output (CO), left ventricular developed pressure (LVDP), the maximum upstroke and decay velocities of left ventricular pressure were recorded. The protein expression level of AMPK and pAMPK were detected by Western blot analysis. ResultsCreatine kinase content of coronary outflow fluid and myocardial water content after re-perfusion in diabetic rats were significantly higher than those in the non-diabetic rats groups (P<0.05). Left ventricular function recovery rate in diabetic groups was significantly lower than that in the non-diabetic groups (P<0.05). The expression levels of AMPK and pAMPK in diabetic rats were significantly lower than those in non-diabetic rats (P<0.05). However, no significant differences in the indexes mentioned above were observed between DMI/R and DMIPC group(P>0.05). ConclusionThe protective effect of myocardial ischemic preconditioning on myocardial

ischemia reperfusion injury in diabetic rats is not obvious, which may be related to the inhibition of AMPK signaling pathway in the myocardium of diabetic rats.

KEYWORDS:ischemic preconditioning; diabetes mellitus; myocardial re-perfusion injury; AMPK

中圖分類號:R 587.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-006-04

DOI:10.7619/jcmp.201607002

通信作者:王巍

基金項目:遼寧省自然科學基金(2013020220)

收稿日期:2015-12-13