肖冰　姜明春　康頌建　孫憲昌

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·基礎研究·

染料木素對噪聲性聾的保護作用△

肖冰姜明春＊康頌建＊孫憲昌＊

【摘要】目的探討植物雌激素染料木素是否具有預防噪聲性聾的作用。方法將30只健康豚鼠隨機分為3組，每組10只。單純噪聲組每日腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，染料木素保護組每日腹腔注射染料木素10 mg/kg，正常對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，3組動物均持續(xù)給藥10 d。除正常對照組以外的2組動物于給藥的第4天開始給予噪聲刺激，連續(xù)7 d。噪聲模式采用4 kHz純音，強度為115 dB SPL，噪聲持續(xù)時間為4 h/d。每組動物在給藥前、后均行聽性腦干反應(ABR)檢測。末次檢測完畢后，在麻醉狀態(tài)下將豚鼠斷頭取耳蝸，采用耳蝸基底膜鋪片技術觀察耳蝸毛細胞的形態(tài)學改變，同時計算外毛細胞損傷率；觀察外毛細胞琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的改變；采用DNA末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測耳蝸螺旋神經節(jié)細胞的凋亡。結果噪聲刺激前，3組動物ABR閾值無明顯差異(P﹥0.05)；接觸噪聲后，單純噪聲組ABR閾值明顯升高(P<0.01)，染料木素保護組ABR閾值較單純噪聲組顯著降低(P<0.01)。耳蝸鋪片及SDH染色結果顯示：單純噪聲組動物耳蝸毛細胞排列紊亂并伴有大量缺失，SDH染色明顯變淺；給予染料木素后，毛細胞缺失明顯減少(P<0.01)，排列較規(guī)則，SDH染色明顯好于單純噪聲組。TUNEL結果顯示：動物接觸噪聲后，螺旋神經節(jié)細胞大量凋亡，染料木素能減輕細胞損傷。結論染料木素對噪聲性聾有一定的防治作用，該作用可能與其營養(yǎng)神經、保護耳蝸毛細胞SDH的活性及線粒體功能有關。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：84-87，95)

【關鍵詞】染料木素；噪聲性聾；雌激素；毛細胞；琥珀酸脫氫酶；凋亡

△基金項目：泰山醫(yī)學院自然科學基金(2011ZR036)

隨著我國工業(yè)化進程的加快，噪聲污染日趨嚴重。長期接觸噪聲可造成聽覺系統(tǒng)的永久性損害導致噪聲性聾(noise-induced hearing loss，NIHL)，嚴重影響人們的生活質量，給個人及社會帶來沉重的精神和經濟負擔。因此，關于NIHL 機制與防治的研究一直是國內外學者研究的熱點。雌激素是一類由內分泌系統(tǒng)分泌的類固醇激素，通過與靶細胞內的雌激素受體(estrogen receptor,ER)結合發(fā)揮作用。有研究[1]顯示，雌激素在體內的作用非常廣泛，除能影響女性生殖內分泌功能外，對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、骨骼均有一定的保護作用。近年來有文獻[2-3]報道，ER在聽覺器官內廣泛分布，推測雌激素與聽覺功能密切相關；進一步的臨床研究與動物實驗均證實雌激素對聽覺系統(tǒng)有保護作用，這為防治NIHL的研究提供了新的思路。但是長期應用雌激素會產生嚴重的不良反應，因此，尋找一種更加安全的具有雌激素樣作用的替代劑具有重要意義[4]。大豆異黃酮是典型的植物雌激素，染料木素(genistein) 是其主要的活性成分， 結構與雌激素相似。流行病學資料已證實，染料木素具有類雌激素作用，對神經退行性疾病、骨質疏松及心血管疾病具有一定的防治作用[5-6]；但染料木素是否能保護聽功能，國內外尚罕見報道。因此，本實驗擬通過建立NIHL豚鼠模型，觀察實驗前、后聽覺功能和耳蝸毛細胞形態(tài)及代謝的變化，研究染料木素對NIHL的保護作用，并探討可能的機制。

1材料與方法

1.1試劑及儀器設備染料木素購自上海同田生化技術有限公司，白色粉末，使用前先用二甲基亞砜(DMSO)溶解，再用生理鹽水將其稀釋到所需濃度；DNA末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotide transferase-mediated deoxyuridine triphosphote-biotin nick end labeling,TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司。其他設備：聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)儀(Bio-logic Navigator PRO;美國)，SC-1型聲刺激器(上海生理研究所)，體視顯微鏡(OLYMPUS SZ61;日本)，普通光學顯微鏡(Leica DM2500;德國)。

1.2實驗動物選取耳廓反射靈敏的健康紅目白毛豚鼠，體重300～350 g，購自山東省生物制品研究所(動物合格證號為魯動質字D20120608號)。在恒溫(21～24 ℃)、恒濕(40%～55%)、自由進食和飲水、明暗各12 h的環(huán)境下飼養(yǎng)，適應環(huán)境7 d后進行實驗。

1.3動物分組豚鼠30只，隨機分為3組，即正常對照組、單純噪聲組、染料木素保護組，每組10只。①染料木素保護組：每天腹腔注射染料木素10 mg/kg，連續(xù)10 d，第4天起給藥后2 h接觸噪聲。②單純噪聲組：每天腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，持續(xù)10 d,并于實驗第4天開始給予噪聲暴露。③正常對照組：每天腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，持續(xù)10 d，不給予噪聲處理。

1.4噪聲暴露方法將動物分別置于獨立分隔的長方形鐵絲籠內，籠子置于自制隔音箱(箱壁由雙層木板組成，中間填充泡沫隔音材料)中央。隔音箱內背景噪聲<40 dB SPL，暴露噪聲由SS-1型聲刺激器發(fā)出經功率放大器放大后傳至揚聲器，揚聲器懸掛于隔音箱上方，聲源距動物約25 cm；噪聲性質為4 kHz純音，給聲強度為115 dB SPL，暴露時長為4 h，經監(jiān)測保證隔音箱內各處噪聲強度差別<5 dB。

1.5ABR測定所有動物在噪聲暴露前和實驗結束后各測1次ABR。動物在清醒狀態(tài)下用固定裝置固定后置于隔音屏蔽室內進行測試。將記錄電極插入豚鼠顱頂正中，參考電極和接地電極分別插入同側和對側乳突部；采用短聲(click)刺激，經EDL-903型耳機輸出(聲源距耳0.5 cm)，頻率13次/s，濾波帶寬為80～3 000 Hz，疊加500次，以Ⅲ波剛出現(xiàn)時的最小刺激強度判斷閾值，重復2次，取平均值。

1.6耳蝸基底膜鋪片及琥珀酸脫氫酶染色每組各取5只動物，乙醚麻醉后迅速斷頭取出雙側聽泡；打開聽泡，用細針在蝸尖鉆孔，開放蝸窗(圓窗)和前庭窗(卵圓窗)；用吸管吸取新鮮配制的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)作用液[0.2 mol/L琥珀酸鈉、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)、0.1%硝基四氮唑藍，配置比例為1∶1∶1]，從蝸尖小孔緩慢注入，最后經蝸窗(圓窗)和前庭窗(卵圓窗)流出，共灌注2～3次；然后將耳蝸浸入SDH作用液中，37 ℃孵育1～2 h；再用10%多聚甲醛溶液自蝸頂灌流3次，并將標本浸入10%多聚甲醛溶液后固定過夜；10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)溶液中脫鈣2周后在立體顯微鏡(解剖顯微鏡)下剝去蝸殼，分離基底膜置于載玻片上，70%甘油封片，光學顯微鏡下觀察毛細胞內SDH的變化及基底膜各回外毛細胞缺失情況。毛細胞計數參考茅犁春等[7]描述的方法，選取第一、二、三回中下部3個視野內的外毛細胞進行計數，視野周邊不完整的毛細胞，只記一邊，即計左不計右，計上不計下。統(tǒng)計學比較時以正常對照組均數為基準。

1.7耳蝸石蠟切片標本制備每組取5只動物的耳蝸制作石蠟切片標本。動物麻醉后斷頭處死，快速取出聽泡，暴露耳蝸，蝸尖鉆孔，打開前庭窗(卵圓窗)及蝸窗(圓窗)，吸管吸取4%多聚甲醛從蝸尖小孔灌入耳蝸，每個標本灌流4～5次，然后將標本浸入固定液中過夜。固定好的聽泡浸入10%EDTA溶液中，室溫下脫鈣2周，脫鈣液每日更換1次，以骨質軟化為標準。低熔點石蠟包埋，平行于蝸軸方向進行連續(xù)切片，片厚8 μm；用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色及細胞凋亡檢測。

1.8凋亡細胞的檢測采用TUNEL檢測凋亡細胞。將切片常規(guī)脫蠟入水，0.3%過氧化氫(雙氧水)孵育10 min，雙蒸水沖洗3次。將玻片浸入盛有0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)的燒杯中，750 W微波下加熱5 min，自然冷卻，PBS沖洗。每張切片加50 μL TUNEL反應液[內含5 μL 10×末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)和45 μL熒光素標記的核苷酸(dUTP)，現(xiàn)用現(xiàn)配]，37 ℃濕盒內孵育60 min。PBS沖洗3次，加入適量POD轉換劑，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗后加入適量底物顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。于400倍光學顯微鏡下觀察耳蝸各回所對應的螺旋神經節(jié)內細胞的凋亡情況，陽性細胞的細胞核染成棕黃色并伴有不同程度的形態(tài)改變或固縮。

2結果

2.1ABR檢測噪聲暴露前、后各組動物ABR閾值見表1。正常對照組實驗前、后ABR閾值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，單純噪聲組動物接噪后ABR反應閾值明顯高于噪聲暴露前(P<0.01)。噪聲暴露后，染料木素保護組閾值顯著低于單純噪聲組(P<0.05)。

表1　各組動物給藥前、后ABR閾值變化情況±s)

注：a示與正常對照組比較P<0.01；b示與染料木素保護組比較P<0.05；C示與正常對照組比較，P<0.05

2.2耳蝸基底膜鋪片及SDH染色正常對照組豚鼠耳蝸在光學顯微鏡下可見排列整齊的3排外毛細胞和1排內毛細胞，毛細胞內有深紫藍色沉淀，細胞染色均勻、輪廓清晰，SDH活性較強(圖1)。單純噪聲組豚鼠耳蝸毛細胞SDH染色明顯減弱；細胞排列紊亂、輪廓不清，外毛細胞明顯受損，其中以第一、二回損傷較為嚴重；而內毛細胞基本正常。接噪過程中給予染料木素保護的豚鼠耳蝸毛細胞SDH染色比正常變淺，外毛細胞也有部分損傷缺失；但與單純噪聲組比較，毛細胞SDH染色基本正常，細胞缺失數量明顯減少，排列基本規(guī)則。

圖1.　3組豚鼠耳蝸螺旋神經節(jié)細胞TUNEL染色結果(400×)A. 正常對照組；B. 單純噪聲組；C. 染料木素保護組

2.3耳蝸外毛細胞計數400倍顯微鏡下選取耳蝸基底膜各回連續(xù)3個視野，觀察外毛細胞缺失率。正常對照組外毛細胞排列整齊，無明顯缺失；單純噪聲組豚鼠耳蝸外毛細胞呈片狀缺失，損傷嚴重，缺失率達41.7%，數量明顯多于染料木素保護組(25.7%)(P<0.01)(表2)。

2.43組耳蝸螺旋神經節(jié)TUNEL染色光學顯微鏡下觀察，正常對照組豚鼠耳螺旋神經節(jié)內未發(fā)現(xiàn)明顯的棕黃色TUNEL染色陽性細胞。單純噪聲組豚鼠耳蝸各回對應的螺旋神經節(jié)內均發(fā)現(xiàn)胞核固縮、呈棕黃色的TUNEL陽性細胞，并且部分螺旋神經節(jié)細胞發(fā)生空泡樣改變甚至缺失；其中底回對應的螺旋神經節(jié)內陽性細胞數量最多并伴有明顯的細胞缺失。給予染料木素保護的豚鼠耳螺旋神經節(jié)內也有TUNEL陽性細胞出現(xiàn)，并伴有細胞缺失，但數量比單純噪聲組動物明顯減少(圖2)。

表2　各組動物實驗后3個視野外毛細胞計數±s；個)

注：a示與對照組比較，P<0.01；b示與染料木素保護組比較，P<0.01；c示與正常對照組比較，P<0.05

圖2.3組豚鼠耳蝸螺旋神經節(jié)TUNEL染色結果(400×)
A. 正常對照組豚鼠耳蝸螺旋神經節(jié)未見棕黃色陽性凋亡細胞；B. 單純噪聲組，螺旋神經節(jié)內可見大量棕黃色、核固縮的陽性細胞(如箭頭所示)；C. 染料木素保護組，可見少量的TUNEL陽性細胞

3討論

NIHL是指人們長期遭受噪聲或短時接受強噪聲而導致的一種感音神經性聾。近年來，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢；因此，如何預防NIHL的發(fā)生，降低其聽覺損害已成為一項亟須解決的課題。

本實驗應用115 dB SPL強度的穩(wěn)態(tài)噪聲對豚鼠進行持續(xù)暴露，NIHL組動物接觸噪聲后ABR閾值明顯升高，閾移平均超過30 dB；耳蝸底回和中回外毛細胞及對應的螺旋神經節(jié)內神經元損傷嚴重。這些損傷特點與文獻[7]報道一致，成功建立了NIHL動物模型。關于NIHL的詳細發(fā)病機制目前尚未明確，但是通過以往的研究可知，NIHL的發(fā)生主要與噪聲所致的內耳氧自由基增加、微循環(huán)障礙及能量代謝紊亂有關[8]。線粒體既是細胞內能量代謝的主要場所，又是細胞自由基生成的主要部位，因此線粒體功能是否正常與NIHL的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。SDH是存在于細胞線粒體內膜的一種重要氧化還原酶，參與三羧酸循環(huán)的ATP生成過程，因其定位清楚，已成為檢測線粒體功能的標志酶[9]。本實驗通過SDH染色，觀察動物接觸噪聲后內耳毛細胞線粒體功能及能量代謝的改變。實驗結果顯示，噪聲暴露后，耳蝸毛細胞內SDH染色明顯變淺，伴有大片缺失，說明噪聲引起毛細胞內線粒體呼吸鏈顯著破壞，進而減少了ATP的生成，加速了能量代謝的衰竭；同時使毛細胞內產生大量的自由基，最終導致了毛細胞的損傷與死亡，引起聽覺功能障礙。因此，可以認為線粒體的能量轉換在NIHL的發(fā)生中起著關鍵作用。

關于NIHL的防治一直是耳科學研究的熱點問題。近幾年的研究[1，10-11]發(fā)現(xiàn)，雌激素對聽覺系統(tǒng)具有保護作用。有研究[12]指出,內耳毛細胞及螺旋神經節(jié)上存在大量的ER，雌激素可作用于內耳發(fā)揮作用，清除內耳自由基，改善內耳微循環(huán)，保護線粒體功能，從而對聽覺功能起到保護作用。雌激素的這種作用為研發(fā)NIHL的防治藥物提供了新的思路；但臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期使用雌激素可增加罹患生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的風險，對于患者而言其帶來的危害遠大于收益，因此大大限制了它的應用[13]。所以尋找一種既能夠發(fā)揮雌激素樣保護作用又沒有嚴重不良反應的替代品是研究重點。染料木素的化學結構與雌二醇相似，可與雌激素受體結合發(fā)揮作用，而且能防止雌激素替代治療出現(xiàn)的嚴重不良反應，被認為是雌激素的天然替代品，已逐漸受到人們的關注[14]。但染料木素對聽功能是否具有保護作用尚罕見報道，因此本實驗觀察了染料木素對NIHL的作用。結果表明，染料木素能明顯減輕動物接觸噪聲后所致的ABR閾值提高、耳蝸外毛細胞損傷及螺旋神經節(jié)內神經元的凋亡，說明染料木素能保護動物的聽功能，對NIHL具有一定的防護作用。其作用機制可能與染料木素的雌激素樣作用有關，染料木素可與內耳毛細胞及螺旋神經節(jié)內神經元上的ER結合，發(fā)揮抗氧化、清除自由基、改善微循環(huán)的作用，從而保護線粒體的功能，防止毛細胞的大量損傷；而染料木素減輕螺旋神經元凋亡的作用可能與其促進神經營養(yǎng)因子的釋放、保護神經元的功能有關[15]。當然，染料木素的詳細作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，本實驗利用NIHL動物模型，首次揭示了植物雌激素染料木素對NIHL的保護作用，這為研究NIHL的防治提供了新的策略及實驗依據。

參 考 文 獻

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(本文編輯楊美琴)

Protection of genistein against noise-induced hearing loss

XIAOBing,JIANGMing-chun＊,KANGSong-jian＊,SUNXian-chang＊.

Tai’anFouthSanatoriumforRetiredCadres,Tai’anMilitarySubarea,Tai’an271000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of genistein on preventing noise-induced hearing loss(NIHL) in guinea pigs. MethodsThirty healthy guinea pigs with normal auricle reflex were randomly divided into the following 3 groups (10 guinea pigs in each group): treatment group with saline (1 mL/kg), treatment group with genistein (10 mg/kg), and normal control group treated with saline(1 mL/kg). The drug administration lasted for a consecutive 10 days. After 3 days of administration, all of the animals except for normal group were simultaneously exposed to steady white noise at 115 dB SPL for 4 h/d, and lasted for 7 days. Auditory brainstem response(ABR) was tested to study the variation of the auditory function. The morphological changes of hair cells were observed on the stretched preparation of basilar membrane. The variety of succinate dehydrogenase(SDH) of hair cells was observed by light microscope. The apoptosis of spiral ganglion cells was observed by terminal deoxynucleotide transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling method. ResultsThere was no significant difference(P>0.05) between ABR threshold values of the three groups before noise exposure．After noise exposure, the ABR threshold value was significantly increased in the simple noise group(P<0.01). However, animals that received genistein treatment showed a significantly lower ABR threshold(P<0.01) . The SDH chemical reaction color obviously disappeared in cochlear hair cells of guinea pigs in noise group；there was a light change of the SDH level in genistein-treated animals compared to normal animals．Compared to the noise group，the apoptosis of spiral ganglion cells were significantly lower in treatment group with genistein. ConclusionsGenistein can reduce the injury of the cochlear induced by NIHL and protect the vitality of mitochondrial respiratory enzyme in the cochlear hair cells. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:84-87,95)

【Key words】Genistein; Noise-induced hearing loss; Estrogen； Hair cell; Succinate dehydrogenase；Apoptosis

(收稿日期2015-05-12)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.005

通訊作者：孫憲昌(Email: hotsss@163.com)

Corresponding author：SUN Xian-chang, Email: hotss@163.com

作者單位：泰安軍分區(qū)第四干休所衛(wèi)生所泰安271000；＊泰山醫(yī)學院生理教研室泰安271000