陳錫赟，王恒，余躍生，陳燕，賀勇，張玲敏，許鍵煒,3 (黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥理學(xué)教研室，貴州都勻 558003；貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室；3貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心)

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蟾衣提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用

陳錫赟1，王恒1，余躍生1，陳燕2，賀勇2，張玲敏2，許鍵煒2,3(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥理學(xué)教研室，貴州都勻 558003；2貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室；3貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心)

摘要：目的 觀察蟾衣提取物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用。方法將60只SD大鼠隨機(jī)分為治療組、模型組和對(duì)照組各20只。模型組和治療組于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)一次性注射0.1 mL 弗氏完全佐劑，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。治療組造模3周后按2 mL/kg腹腔注射蟾衣提取物，1次/d，連續(xù)給藥3周，模型組和對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。在造模當(dāng)天及造模后第1、2、3、4、5、6、7周分別測(cè)量大鼠體質(zhì)量、左右后爪體積，各組大鼠在治療第4周后行四肢關(guān)節(jié)X線攝片檢查及四肢關(guān)節(jié)病理檢查，觀察大鼠不良反應(yīng)發(fā)生情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組造模后3、4、5、6、7周左、右后爪體積大(P均<0.05)。與模型組相比，治療組造模后5、6、7周左、右后爪體積小(P均<0.05)。X線檢查結(jié)果顯示，治療組大鼠后肢爪關(guān)節(jié)與對(duì)照組相似，較模型組骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)破壞明顯修復(fù)，關(guān)節(jié)面光滑，周圍軟組織影增厚減輕。HE染色結(jié)果顯示，治療組足趾關(guān)節(jié)面較光滑，增生不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，關(guān)節(jié)間隙出現(xiàn)，邊緣骨質(zhì)破壞不明顯，與對(duì)照組相似。各組大鼠未見明顯不良反應(yīng)。結(jié)論蟾衣提取物可有效減輕并修復(fù)大鼠AA所致的損傷。

關(guān)鍵詞：蟾衣提取物；佐劑性關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

目前，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[1～3]采用的非甾體類抗炎藥治療僅能使患者的癥狀得到一定緩解，但不能有效地阻斷RA的發(fā)生發(fā)展，而且長(zhǎng)期使用該類藥物還會(huì)出現(xiàn)一系列不可避免的不良反應(yīng)。因此，尋找療效更好、副作用更少的藥物成為醫(yī)藥工作者追求的目標(biāo)。一些中藥、民族藥在治療RA方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。蟾衣，又稱蟾蛻，含蟾蜍二烯醇化合物，包括蟾蜍毒素、蟾蜍內(nèi)酯類、蟾毒配質(zhì)等[4,5]。近年來(lái)研究[6,7]發(fā)現(xiàn)，蟾衣中所含的蟾毒內(nèi)酯、蟾毒素等有解毒、消腫、止痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射以及調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用，能有效改善人體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)人體代謝平衡。弗氏完全佐劑(FCA)是由抗原水溶液與石蠟油、羊毛脂和分枝桿菌按一定比例混合成的強(qiáng)免疫制劑，采用FCA可建立與臨床RA類似的動(dòng)物疾病模型[8]。本研究采用蟾衣提取物治療FCA誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠，為臨床RA的治療提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器Sprague Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量(100±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供，貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)，合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。蟾衣由貴州省開陽(yáng)縣龍崗鎮(zhèn)立京村蟾蜍養(yǎng)殖戶董英奎友情饋贈(zèng)；FCA(美國(guó)Sigma公司)；水浴鍋(泰斯特DK-98-HA型四孔，天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA OSB-2100型，東京理化)；2100型數(shù)字式口腔X線機(jī)(法國(guó)Kodak公司)。

1.2蟾衣提取物的制備參照文獻(xiàn)[9]并加以改進(jìn)，將干燥的蟾衣粗粉200 g，以10倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，靜置，析出沉淀，過濾，濾液濃縮得到浸膏2.28 g，得率為1.14%。

1.3AA大鼠模型的制備及蟾衣提取物用法所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為治療組、模型組和對(duì)照組各20只。醫(yī)用酒精棉球局部消毒，模型組和治療組于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)一次性注射0.1 mL FCA[3]，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。治療組造模3周后即第21天，按2 mL/kg腹腔注射蟾衣提取物(以1%濃度溶于生理鹽水)，1次/d，固定注射時(shí)間點(diǎn)，連續(xù)給藥3周。模型組和對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4觀察方法觀察各組大鼠的生命體征。在造模當(dāng)天及造模后第1、2、3、4、5、6、7周分別測(cè)量大鼠體質(zhì)量、左右后爪體積。爪體積的測(cè)量采用排水法，即用一特制量筒，灌滿水后，將大鼠爪插入，以大鼠踝關(guān)節(jié)突出部位作為標(biāo)記，使其處于水平面，用一燒杯收集測(cè)量從量筒側(cè)口排出的水量(mL)，即為所測(cè)大鼠爪的體積[10]。各組大鼠在治療第4周后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后行四肢關(guān)節(jié)X線攝片檢查(采用口腔科移動(dòng)式牙片X光機(jī)，電壓、電流與曝光時(shí)間分別設(shè)定在60 kV、7 mA和0.10 ms)[10]，之后頸椎脫臼法處死大鼠，行四肢關(guān)節(jié)病理檢查。治療前后全程觀察大鼠不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2結(jié)果

各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中生命體征平穩(wěn)，造模后大鼠活動(dòng)、食量較造模前以及正常組減少，毛色晦暗，關(guān)節(jié)腫脹逐漸加重，各組大鼠體質(zhì)量、左右后爪體積比較見表1～3。影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠后肢足趾關(guān)節(jié)骨端出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，有鋸齒狀改變，關(guān)節(jié)面模糊，邊緣骨質(zhì)破壞；關(guān)節(jié)間隙狹窄，周圍軟組織腫脹；治療組大鼠后肢足趾關(guān)節(jié)與對(duì)照組相似，較模型組骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)破壞明顯修復(fù)，關(guān)節(jié)面光滑，周圍軟組織影增厚減輕。病理切片HE染色顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜明顯增生，滑膜內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部侵蝕到軟骨中，腔隙消失，甚至纖維化；治療組足趾關(guān)節(jié)面較光滑，增生不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙，邊緣骨質(zhì)破壞不明顯，與對(duì)照組相似。各組大鼠未見明顯不良反應(yīng)。

表1　各組大鼠體質(zhì)量比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

表2　各組大鼠右后爪體積比較±s)

注：與模型組比較，*P<0.05。

表3　各組大鼠左后爪體積比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3討論

RA所致的關(guān)節(jié)破壞誘發(fā)的關(guān)節(jié)疼痛、晨僵以及很高的致殘率嚴(yán)重影響人類的健康和生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的西醫(yī)治療多數(shù)僅能緩解癥狀，而難以治愈。且有部分復(fù)發(fā)性、難治性RA患者對(duì)傳統(tǒng)治療反應(yīng)差，臨床療效不滿意。而長(zhǎng)期病情活動(dòng)的后果則是失去勞動(dòng)能力和縮短生存期[2]。

RA的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，可能與免疫功能紊亂所致的自身免疫性炎癥相關(guān)。雖然沒有確認(rèn)引發(fā)RA的具體抗原，但多種內(nèi)、外源性抗原可能均不同程度參與了RA的發(fā)生。關(guān)節(jié)組織損傷和細(xì)胞凋亡釋放的自身抗原未被免疫系統(tǒng)適應(yīng)，進(jìn)而被產(chǎn)生的特異性抗體結(jié)合。RA存在著促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子的失衡。RA患者的關(guān)節(jié)中存在大量CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，分泌的細(xì)胞因子如TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附滲透，同時(shí)局部成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的釋放促進(jìn)了血管翳的形成；另外還可促使巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及纖維母細(xì)胞等產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1等誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步促進(jìn)了淋巴細(xì)胞由血管內(nèi)向滑膜的遷入、活化，軟骨細(xì)胞、滑膜母細(xì)胞分泌的前列腺素E2和膠原酶還能增強(qiáng)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1的效應(yīng)，參與RA的發(fā)生發(fā)展過程，加重組織損傷[11，12]。自身反應(yīng)性B細(xì)胞也參與RA的發(fā)生。B細(xì)胞被激活后，產(chǎn)生類風(fēng)濕因子、IL-6和TNF-α，還可誘導(dǎo)其向漿細(xì)胞分化，參與RA的發(fā)病[13,14]。蟾衣中的活性物質(zhì)可下調(diào)炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB激活，進(jìn)而抑制上述各種炎癥介質(zhì)來(lái)發(fā)揮抗炎作用[5]。

中醫(yī)認(rèn)為RA屬痹癥，體虛感邪、風(fēng)寒濕邪是發(fā)生本病的內(nèi)、外因素，經(jīng)絡(luò)痹阻是主要病機(jī)[15]。蟾衣性涼，味辛，有微毒，具有扶正固本、攻堅(jiān)破瘀、消腫祛癌等作用[16]，能有效增強(qiáng)人體體質(zhì)和免疫功能，促進(jìn)生命代謝自然平衡，可用于包括各種炎癥及腫瘤在內(nèi)的許多疾病的治療[4]。本研究選用貴州純天然無(wú)污染飼養(yǎng)環(huán)境中獲得的一級(jí)蟾衣提取物腹腔注射治療與人RA類似的大鼠AA，此給藥途徑能盡可能避免首關(guān)消除效應(yīng)帶來(lái)的生物利用度下降，最大程度地發(fā)揮藥效。最終本實(shí)驗(yàn)證實(shí)蟾衣提取物能有效抑制AA大鼠的病情進(jìn)展，修復(fù)病損組織，這將為自身免疫性疾病乃至其他疾病的治療提供新的思路。

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(收稿日期：2015-11-12)

中圖分類號(hào)：R593.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)11-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.011

通信作者：許鍵煒(E-mail： 363912577@qq.com)

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題計(jì)劃(QZYY2013-91)；黔南醫(yī)?？蒲谢痦?xiàng)目(QNYZ201412)。