馬帥，郭振奎，丁文宇，張勇，康曉麗，游雅麗(1濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南5006；山東省內(nèi)分泌與代謝病研究所)

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1個早發(fā)糖尿病合并腎發(fā)育異常家系的HNF1β基因分析

馬帥1,2，郭振奎2，丁文宇2，張勇2，康曉麗1,2，游雅麗1,2(1濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南250062；2山東省內(nèi)分泌與代謝病研究所)

摘要：目的分析1個符合青少年起病的成人糖尿病5型(MODY5)的早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫家系，探討其家系MODY5臨床表型與肝細胞核因子1β(HNF1β)基因的關(guān)系。方法選擇發(fā)現(xiàn)的1個MODY5患者家系，另選擇健康體檢者2例作為對照。對MODY5患者進行家系調(diào)查，收集家庭成員[包括先證者(Ⅱ4)、引產(chǎn)胎兒(Ⅲ1)、大姐(Ⅱ1)、二姐 (Ⅱ2)、三姐 (Ⅱ3)、父親(Ⅰ1)]的疾病史。采集該家系中引產(chǎn)胎兒(Ⅲ1)脾臟，抽取該家系其他健在成員及對照者外周靜脈血，提取外周血有核細胞DNA，應用聚合酶鏈式反應技術(shù)對HNF1β基因進行擴增及測序分析。結(jié)果先證者(Ⅱ4)、先證者父親(Ⅰ1)、三姐(Ⅱ3)均為早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫，先證者大姐(Ⅱ1)為多發(fā)性腎囊腫，二姐(Ⅱ2)僅有糖尿病一種表型?；驕y序發(fā)現(xiàn)先證者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因第9外顯子1968A>G、2142T>A、2312A>C編碼區(qū)發(fā)生突變，家系其他成員及對照者未發(fā)現(xiàn)外顯子編碼區(qū)HNF1β基因突變。結(jié)論在該MODY5家系中僅發(fā)現(xiàn)1例HNF1β基因突變，MODY5臨床表型與HNF1β基因型存在較大的異質(zhì)性。

關(guān)鍵詞：肝細胞核因子1β；腎發(fā)育異常；青少年起病的成人糖尿病

青少年起病的成人糖尿病(MODY)是一種呈常染色體顯性遺傳特點的單基因突變糖尿病，迄今已發(fā)現(xiàn)13種MODY亞型。在各種亞型中，MODY5亞型占MODY總?cè)藬?shù)的2%～5%[1]。MODY5亞型最常見的臨床表型為腎臟發(fā)育異常和早發(fā)糖尿病。目前關(guān)于中國人MODY5亞型的報道較少見[2～4]。

2015年10月，我們發(fā)現(xiàn)1個臨床表型符合MODY5亞型的早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫家系，通過對該家系進行MODY5的致病基因肝細胞核因子1β(HNF1β)基因檢測，探討其家系臨床表型與HNF1β基因的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇1個早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫患者家系，包括先證者(Ⅱ4)、先證者子代引產(chǎn)胎兒(Ⅲ1)、大姐(Ⅱ1)、二姐 (Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)、父親(Ⅰ1)。家系中先證者(Ⅱ4)為早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫患者，男，24歲，因多尿、多飲就診于我院，BMI為22.1 kg/m2，血壓128/80 mmHg，隨機靜脈血糖15.24 mmol/L，糖化血紅蛋白10.70%，尿糖(+++)，尿酮體(-)，肝腎功能正常。另選擇同期在我院查體的健康體檢者2例作為對照。

1.2家系調(diào)查對該患者進行家系調(diào)查，詢問家族史、既往史，進行血糖、腎臟B超檢查。

1.3標本收集及DNA提取胎兒36周引產(chǎn)后，經(jīng)我院倫理委員會允許并經(jīng)先證者知情同意后，對胎兒進行尸體解剖。取新鮮脾臟，用DNA試劑盒提取組織細胞DNA，-20 ℃保存，其余組織置于-70 ℃冰箱保存。另抽取該家系其他成員及對照組外周靜脈血2～5 mL，用EDTA抗凝，DNA試劑盒提取外周血有核細胞DNA，低溫-20 ℃保存?zhèn)溆?，并使用核?蛋白濃度測定儀對已提取的DNA樣品進行濃度測定。

1.4HNF1β基因擴增及測序遵守引物設(shè)計原則對HNF1β基因的每個外顯子進行引物設(shè)計，應用聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)對HNF1β基因序列進行多循環(huán)擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大連寶生物工程有限公司PCR純化試劑盒純化后，送上海生物工程有限公司進行測序分析。

2結(jié)果

2.1家系調(diào)查結(jié)果先證者(Ⅱ4)、先證者父親(Ⅰ1)、先證者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)均為早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫，先證者大姐(Ⅱ1)為多發(fā)性腎囊腫。見圖1。①先證者(Ⅱ4)：腹部B超示兩腎出現(xiàn)多個回聲不均、大小不一囊腫。②先證者妻(Ⅱ5)：23歲，第一胎妊娠期間第32周產(chǎn)檢時，經(jīng)B超發(fā)現(xiàn)胎兒(Ⅲ1)左側(cè)腎缺如，右腎正常大小發(fā)育良好，未見囊腫等腎臟發(fā)育畸形，其他器官、部位發(fā)育良好，無畸形或缺如；追蹤Ⅲ1母方家系成員無腎畸形等腎臟發(fā)育異常家族史。③先證者父親(Ⅰ1)：確診糖尿病的年齡為30歲，既往腹部B超示左腎有回聲不均、大小不一的囊腫，37歲時因糖尿病、糖尿病腎病病故。④先證者母親(Ⅰ2)：因患腦梗死病故，生前無血糖異常，追蹤Ⅰ2家系無糖尿病、腎臟發(fā)育異常家族史。⑤先證者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)：確診糖尿病時年齡分別為14、16歲，當時空腹血糖13～14 mmol/L，尿酮體(-)，其中三姐(Ⅱ3)腹部B超示雙腎有多個回聲不均的囊腫，右側(cè)腎發(fā)育不良。Ⅱ2、Ⅱ3確診糖尿病3年后均死于酮癥酸中毒。⑥先證者大姐(Ⅱ1)：30歲，BMI為24.3 kg/m2，血壓128/80 mmHg，OGTT+C肽+胰島素釋放試驗正常，空腹血糖4.6 mmol/L，糖化血紅蛋白為5.4%，腹部B超示兩腎多個回聲不均、大小不一的囊腫。各家庭成員配偶間均為非近親結(jié)婚。由于Ⅱ2、Ⅱ3和Ⅰ1均因糖尿病等急慢性并發(fā)癥去世，未獲得其有效標本和資料。

圖11個MODY5家系圖譜

2.2基因測序結(jié)果先證者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因突變位置均在第9外顯子非編碼區(qū)，分別為第9外顯子第120位基因A/G雜合突變(外顯子1968 A>G)、第9外顯子第294位基因A/T雜合突變(外顯子2142 T>A )、第9外顯子第464位基因C/A雜合突變(外顯子2312 A>C)。先證者(Ⅱ4)與對照者HNF1β外顯子編碼區(qū)域及啟動子區(qū)均無突變位點。胎兒HNF1β外顯子編碼區(qū)域及啟動子區(qū)均無突變位點，其他家系成員因病去世無法獲得有效標本。見圖2、3。

圖2　正常對照者外顯子序列1968位點測序圖

圖3　　　　先證者大姐(Ⅱ1)外顯子序列1968 位點

3討論

MODY糖尿病是一種在家系內(nèi)以常染色體顯性遺傳方式傳遞的早發(fā)糖尿病，臨床表現(xiàn)類似2型糖尿病，但卻比2型糖尿病發(fā)病早，遺傳外顯率高，BMI多在正常范圍，代謝綜合征少見。MODY基因的一個位點拷貝異常就可導致胰島細胞發(fā)育異常、胰島素分泌缺陷等[5]。研究表明，HNF1β突變所致MODY5臨床表型呈高度異質(zhì)性，但最常見的是腎發(fā)育異常表型，大多是與糖尿病腎病無關(guān)的腎臟功能減退、腎囊腫、腎先天畸形、一側(cè)腎缺如等；其次的常見表型是糖尿病，以胰島素分泌障礙為特征，起病年齡多小于25歲[1]。MODY5家系突變在國外報道較多，而在國內(nèi)報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)先證者家系中，先證者(Ⅱ4)、先證者父親(Ⅰ1)、先證者二姐(Ⅱ2)、三姐(Ⅱ3)均為早發(fā)糖尿病合并多發(fā)性腎囊腫，先證者大姐(Ⅱ1)為多發(fā)性腎囊腫,符合MODY5家系特征。

HNF1β基因是MODY5的致病基因[5]。HNF1β的主要靶基因有左旋丙酮酸激酶(PKL)、L型丙酮酸激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT-2)及胰島素基因等，通過參與以上基因的表達，在調(diào)節(jié)β細胞的分泌、參與機體血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6～9]。HNF1β不僅存在于胰島細胞核內(nèi)，還廣泛存在于肝臟、腎臟、肺臟、膽管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等內(nèi)臟細胞，HNF1β突變可導致以上組織中的靶基因表達異常，最終致器官組織細胞發(fā)育分化異常和分化終末細胞功能失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在HNF1β基因多態(tài)位點1968A>G突變中，G等位基因攜帶者空腹血糖、餐后3 h血糖、空腹胰島素、餐后3 h胰島素水平均高于A等位基因型，提示HNF1β基因1968 A>G突變可能導致β細胞負擔加重，導致β細胞分泌功能逐步降低，最終引起糖尿病的發(fā)生[10]。本研究測序結(jié)果示，先證者大姐(Ⅱ1)的HNF1β基因第9外顯子1968 A>G、2142 T>A、2312 A>C編碼區(qū)發(fā)生突變，但OGTT+C肽+胰島素釋放試驗結(jié)果在正常值范圍內(nèi)，未出現(xiàn)糖尿病，對照組無以上HNF1β基因位點突變，推測可能2102、2312位點突變產(chǎn)生反式激活作用來調(diào)控靶基因，從而拮抗1968點突變引起的β細胞分泌缺陷。此為HNF1β基因1968位點突變的個例，具體機制仍需要增加病例樣本進一步探索。

本研究也發(fā)現(xiàn)該家系中存在臨床表型與基因型的異質(zhì)性。先證者(Ⅱ4)父親(Ⅰ1)、三姐(Ⅱ3)雖出現(xiàn)早發(fā)糖尿病、多發(fā)性腎囊腫，但均未檢測到HNF1β外顯子編碼區(qū)域及啟動子區(qū)突變；胎兒(Ⅲ1)腎臟表型表現(xiàn)為左側(cè)腎臟缺如，但其HNF1β基因編碼區(qū)無突變；而大姐(Ⅱ1)雖出現(xiàn)1968A>G突變、合并表型腎囊腫，但未發(fā)現(xiàn)胰島素拮抗情況，以上成員臨床表型與基因型的異質(zhì)性，考慮可能為基因多效性或在內(nèi)含子中存在某些未知的調(diào)控區(qū)域，導致HNF1β基因表達受到不同程度的損害；或與相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)突變(例如同為同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的HNF1α、IPF-1基因)，microRNA也可能參與其中，使HNF1β相關(guān)靶基因的表達產(chǎn)物異?；虍a(chǎn)量下調(diào)所致[12,13]。此外，其他遺傳和環(huán)境因素也可在HNF1β突變的基礎(chǔ)上進行調(diào)控，也可能是造成基因型與臨床表型存在差異，出現(xiàn)高度異質(zhì)性的原因[3]。

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(收稿日期：2015-01-08)

中圖分類號：R587.1；R596

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)14-0052-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.018

通信作者：郭振奎(E-mail: mashuaixiami@163.com)

基金項目：山東省醫(yī)學科學院科研基金面上項目(201207)。