吳春濤，李擁軍(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊05007；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

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miRNA-455在小鼠心室重構(gòu)中的作用及機(jī)制探討

吳春濤1，李擁軍2(1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊050017；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

摘要：目的探討microRNAs-455(miR-455)在心室重構(gòu)中的作用及其機(jī)制。方法 選擇小鼠18只，分為miR-455組、GFP組及假手術(shù)組各6只。miR-455組、GFP組均行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)，術(shù)后4周即進(jìn)展為心室重構(gòu)模型。假手術(shù)組術(shù)中僅游離主動(dòng)脈弓但不結(jié)扎。miR-455組于術(shù)后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被miR-455的腺病毒0.1 mL，GFP組及假手術(shù)組于同時(shí)點(diǎn)尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 mL。術(shù)后4周造模成功，應(yīng)用心臟超聲檢查測量各組左心室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室舒張末容積(LVEDV)、左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)。處死各組大鼠取心室肌行HE及Masson染色，觀察心肌病理改變。采用qRT-PCR法檢測各組心肌組織心肌肥厚基因[包括心房鈉尿因子(ANF)、骨骼肌肌動(dòng)蛋白1(ACTA1)、β肌球蛋白重鏈]及心肌纖維化基因[包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)]表達(dá)。采用Western blot法檢測各組心肌細(xì)胞中凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)。采用TUNEL染色法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果與假手術(shù)組相比，GFP組LVIDd增加、LVEDV增加、LVAWd增厚、EF降低(P<0.01或0.05)；與GFP組相比，miR-455組LVIDd降低、LVEDV降低、LVAWd增厚、EF增加(P<0.01或0.05)。GFP組心肌組織呈心肌肥厚、心肌纖維化病理改變，miR-455組較GFP組心肌肥厚、心肌纖維化病理改變明顯減輕。GFP組各心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，miR-455組各心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達(dá)均低于GFP組(P<0.01或0.05)。與假手術(shù)組相比，GFP組Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增高(P<0.01或0.05)；與GFP組相比，miR-455組Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)增加、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.01或0.05)。結(jié)論miR-455具有抑制心室重構(gòu)、改善心功能的作用，可能與其抑制心肌肥厚、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：miR-455；心室重構(gòu)；心肌肥厚；心肌纖維化；細(xì)胞凋亡;小鼠

長期高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)是心臟不良事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與心源性猝死、心律失常、心力衰竭等密切相關(guān)。心室重構(gòu)可導(dǎo)致心肌肥厚、心肌凋亡、成纖維細(xì)胞增加、膠原纖維增生、心肌代謝異常及電生理改變等，是導(dǎo)致心力衰竭加重的重要原因。探討心室重構(gòu)的機(jī)制，對于了解心力衰竭的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的小分子RNA，可通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)節(jié)目的蛋白參與多種心血管疾病的發(fā)生。但miRNA-455(miR-455)與心室重構(gòu)的關(guān)系尚不明確。2012年7月～2014年12月，我們通過升主動(dòng)脈縮窄(TAC)術(shù)構(gòu)建了心室重構(gòu)小鼠模型，觀察轉(zhuǎn)染miR-455后心室重構(gòu)小鼠心肌肥厚、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的變化，探討miR-455在心室重構(gòu)中的作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與材料雄性、健康昆明小鼠18只，4周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)。包被miR-455的腺病毒(5.0×109ifu/mL)和包被綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒(1.0×109ifu/mL)均購自Invitrogen公司。抗Bax和抗Bcl-2抗體購自博士德公司。GAPDH抗體購自Bio World公司。TUNEL試劑盒購自Roche公司。

1.2動(dòng)物分組及心室重構(gòu)模型制備將小鼠分為miR-455組、GFP組及假手術(shù)組各6只。miR-455組、GFP組均通過升主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)制備心室重構(gòu)模型，麻醉后于左胸骨邊緣約2 mm處沿第二肋間隙打開胸腔，游離主動(dòng)脈弓，于鎖骨下動(dòng)脈(第一分支)和左頸總動(dòng)脈(第二分支)間穿0號(hào)線，然后平行于主動(dòng)脈弓放置27-gauge(直徑0.4 mm)針頭，一同結(jié)扎后抽出針頭，使主動(dòng)脈縮窄65%～70%。TAC術(shù)后4周即進(jìn)展為心室重構(gòu)，成為心室重構(gòu)模型。假手術(shù)組手術(shù)同上，但術(shù)中僅游離主動(dòng)脈弓而不結(jié)扎。

1.3干預(yù)方法miR-455組于TAC術(shù)后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被miR-455的腺病毒0.1 mL。GFP組及假手術(shù)組于TAC術(shù)后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 mL。TAC術(shù)后4周，應(yīng)用頸椎脫臼法處死小鼠，取心肌組織標(biāo)本，行qRT-PCR法檢測心肌組織miR-455表達(dá)，miR-455組心肌組織miR-455表達(dá)高于GFP組，證實(shí)miR-455在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功。

1.4心功能檢測于 TAC術(shù)后4周造模成功后，應(yīng)用心臟超聲檢查評估各組心功能。氯胺酮麻醉，小鼠仰臥位，剪去心前區(qū)毛，應(yīng)用超聲儀頻率為30 MHz的探頭在胸壁上行胸骨旁長軸、短軸、心尖和劍突切面超聲檢查，測量左心室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室舒張末容積(LVEDV)、左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.5心肌組織病理改變觀察超聲檢查后應(yīng)用頸椎脫臼法處死各組小鼠，迅速取出心臟，取心室肌，行HE及Masson染色，應(yīng)用Motic 6.0分析軟件于顯微鏡下觀察心肌病理改變。

1.6心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達(dá)檢測采用qRT-PCR法，檢測各組心肌組織中心肌肥厚基因包括心房鈉尿因子(ANF)、骨骼肌肌動(dòng)蛋白β1(ACTA1)、β肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)，心肌纖維化基因包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)mRNA表達(dá)。

1.7心肌凋亡蛋白表達(dá)檢測采用Western blot法檢測各組心肌細(xì)胞中凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)。以兔抗人GAPDH 抗體(1∶5 000)作為內(nèi)對照。抗原-抗體復(fù)合物用雙色紅外激光掃描儀進(jìn)行掃膜。采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶積分光密度值(IOD)，以靶蛋白與GAPDH的IOD比值反映靶蛋白相對表達(dá)量。

1.8心肌細(xì)胞凋亡檢測將各組心肌組織標(biāo)本用石蠟包埋后切片，使用TUNEL試劑盒染色，每張切片隨機(jī)取6個(gè)高倍鏡視野，檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核中凋亡細(xì)胞核的個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)。

2結(jié)果

2.1各組心功能比較見表1。

表1　各組心功能結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01。

2.2各組心肌組織病理改變HE染色：假手術(shù)組心室壁厚度正常，心肌細(xì)胞排列整齊、大小正常，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核染色均勻；GFP組心室壁厚度增厚，心肌細(xì)胞橫截面積增大；miR-455組較GFP組心室壁厚度進(jìn)一步增厚，心肌細(xì)胞進(jìn)一步增大，心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)濃染，細(xì)胞間距增大，細(xì)胞核空染增多。Masson染色：假手術(shù)組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細(xì)胞間隙，GFP組心肌膠原纖維較假手術(shù)組明顯增加，miR-455組心肌膠原纖維較GFP組明顯減少。

2.3各組心肌肥厚基因及心肌纖維化基因表達(dá)比較見表2。

表2　各組心肌肥厚基因、心肌纖維化基因表達(dá)比較±s,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01。

2.4各組心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)比較詳見見表3、圖1。

2.5各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較見表3。

表3　各組心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GFP組比較，▲P<0.05。

圖1　　　　各組心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

3討論

miRNAs是長21～25 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)廣泛參與心血管系統(tǒng)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、凋亡等病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-350、miR-21、miR-23a、miR-24、miR-208、miR-195、miR-19等與心肌肥厚有關(guān)[1～3]，miR-29及miR-21與心肌纖維化有關(guān)[4,5]，miR-133a與缺血性心臟病有關(guān)[6,7]，miR-129與心力衰竭有關(guān)[8]。miR-455是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNAs，其5′端有6個(gè)核苷酸序列，與鈣網(wǎng)蛋白(Calr)匹配完好，而Calr與心室重構(gòu)關(guān)系密切，這一分子結(jié)構(gòu)提示miR-455可能在心室重構(gòu)的發(fā)生中發(fā)揮一定作用。

高血壓病時(shí)心臟的前后負(fù)荷增加，可導(dǎo)致左心室肥厚及心腔擴(kuò)大，出現(xiàn)左心室重構(gòu)。早期的左心室重構(gòu)以心肌細(xì)胞肥大為主，是心臟對壓力負(fù)荷增加的代償，以降低升高的室壁張力，維持甚至增加射血分?jǐn)?shù)。當(dāng)病變進(jìn)展到后期時(shí)，左心室重構(gòu)以心肌凋亡和膠原纖維異常增加為主，出現(xiàn)EF進(jìn)行性降低，成為導(dǎo)致心功能惡化、心力衰竭加重的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，GFP組LVIDd增加、LVEDV增加、LVAWd增厚、EF降低，提示心室重構(gòu)小鼠的心肌收縮力下降、EF降低，出現(xiàn)心功能降低；與GFP組相比，miR-455組LVIDd降低、LVEDV降低、LVAWd增厚、EF增加，提示miR-455改善了心功能，可能與其抑制心室重構(gòu)進(jìn)展有關(guān)。

心肌肥厚是心肌組織對高血壓時(shí)室壁張力增高的一種反應(yīng)。在離體心肌組織和在體心臟中，室壁張力增高是導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的直接刺激因素。這種效應(yīng)可能由離子通道介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH或胞內(nèi)信使分子如cAMP的濃度，從而使mRNA增多，促使心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、出現(xiàn)心肌肥大。此外，心室重構(gòu)后去甲腎上腺素α受體增多也可刺激心肌細(xì)胞增長，使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增高，加速蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，GFP組心肌組織病理呈心肌肥厚改變，心室壁厚度增厚，心肌細(xì)胞橫截面積增大，心肌肥厚基因ANF、ACTA1、β肌球蛋白重鏈mRNA表達(dá)均增加，提示心室重構(gòu)小鼠出現(xiàn)心肌肥厚病理改變；與GFP組相比，miR-455組心肌肥厚病理改變程度減輕，心肌肥厚基因ANF、ACTA1 mRNA表達(dá)降低，提示miR-455可能通過抑制心肌肥厚基因的表達(dá)抑制心肌肥厚的進(jìn)展，考慮GFP組可能進(jìn)入心室重構(gòu)的心力衰竭階段，而miR-455組尚停留于心肌肥厚的早期階段，可能與miR-455延緩心室重構(gòu)進(jìn)展有關(guān)。

在高血壓病血流動(dòng)力學(xué)改變、神經(jīng)-內(nèi)分泌-細(xì)胞因子激活等作用下發(fā)生心臟重構(gòu)后，可出現(xiàn)心肌間質(zhì)的重構(gòu)，主要表現(xiàn)為血管增生、交感神經(jīng)元軸突增長、成纖維細(xì)胞增殖、早期Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)、后期Ⅰ型膠原及前膠原蛋白mRNA增加等，導(dǎo)致Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加，出現(xiàn)左心室僵硬，影響其舒張功能[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，GFP組心肌組織呈纖維化樣改變，心肌膠原纖維較假手術(shù)組明顯增加，心肌纖維化基因TGF-β1、CTGF mRNA的表達(dá)均增高，提示GFP組發(fā)生心肌纖維化；與GFP組相比，miR-455組心肌膠原纖維明顯減少，心肌纖維化基因TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá)降低，提示miR-455抑制了心肌纖維化進(jìn)展，可能與其抑制心肌纖維化基因表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致心力衰竭的重要原因。心力衰竭終末期，平均每百萬個(gè)心肌細(xì)胞就有2 318個(gè)發(fā)生凋亡，比正常細(xì)胞高232倍[10]。衰竭心臟的特征性變化是由于細(xì)胞凋亡和壞死引起的進(jìn)行性心肌細(xì)胞喪失、心肌肥大等。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，GFP組凋亡蛋白Bax表達(dá)增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增高，提示GFP組心肌凋亡現(xiàn)象明顯；與GFP組相比，miR-455組凋亡蛋白Bax表達(dá)降低、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，提示miR-455抑制了心室重構(gòu)后的心肌細(xì)胞凋亡，可能與其下調(diào)Bax蛋白、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

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(收稿日期：2015-08-08)

中圖分類號(hào)：R542.2；R544.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)14-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.013