趙亞男，劉明，張玥，王彬，張玉冬，郝清智(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南5004；山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

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糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的建立

趙亞男1，劉明2，張玥2，王彬2，張玉冬2，郝清智2(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要：目的 建立一種糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型。方法將34只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組和DM組各17只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分別給予常規(guī)飼料及高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周；DM組腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素，對照組腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，4周后于兩組大鼠背部制作直徑約2.5 cm的圓形創(chuàng)面；創(chuàng)面造模后第3、7、14天，觀察兩組大鼠創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算創(chuàng)面愈合率，HE染色法觀察創(chuàng)面組織病理變化。結(jié)果DM組創(chuàng)面愈合率分別為5.21%±0.94%、31.70%±1.21%、62.20%±1.37%，對照組分別為20.87%±1.39%、49.99%±1.58%、91.60%±1.58%，兩組同時(shí)點(diǎn)比較P均<0.05。與對照組相比，其創(chuàng)面組織中含有較少的炎性細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及新生毛細(xì)血管。結(jié)論高脂高糖飼料飼養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射制作2型糖尿病模型，維持高血糖4周后采用外科方法制作潰瘍模型，可成功建立糖尿病難愈性創(chuàng)面模型。

關(guān)鍵詞：糖尿病；潰瘍；難愈性創(chuàng)面；動物模型

潰瘍是糖尿病(DM)的常見并發(fā)癥之一，常遷延難愈，嚴(yán)重影響患者的病情及生活質(zhì)量[1,2]。因此，從動物模型研究其發(fā)病機(jī)制十分關(guān)鍵。目前國內(nèi)多以大劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)制備DM模型，并隨即制備糖尿病潰瘍(DU)模型[3,4]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。但該方法存在兩個問題，一是大劑量注射STZ會破壞大量胰腺細(xì)胞，引起胰島素分泌下降，與DM病理過程及臨床特征不符；二是血糖升高后尚未造成對皮膚的影響就進(jìn)行潰瘍造模，與DU病理過程不符。2014年6～9月，我們采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法制作DM模型，并維持血糖長時(shí)間升高后再制作潰瘍模型，以期成功模擬DM難愈性創(chuàng)面。

1材料與方法

1.1材料清潔級雌性Wistar大鼠34只，體質(zhì)量160～180 g，購自山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心；高脂高糖飼料(59%基礎(chǔ)飼料+20%蔗糖+18%豬油+3%蛋黃)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作；STZ(Sigma公司，美國)；羅氏血糖儀(德國)；超低溫冰柜(725 Thermo Forma，美國)；石蠟切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)(Lecia，德國)；CX40普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；氯仿、無水乙醇、異丙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉等(天津廣成化學(xué)試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1DM模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為對照組和DM組各17只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，記錄兩組大鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量、排泄量，并斷尾取血測定大鼠隨機(jī)血糖。對照組給予普通飼料，DM組給予高脂高糖飼料。兩組均禁食12 h，DM組予1%的STZ溶液30 mg/kg單次腹腔注射，對照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后第3 天測隨機(jī)血糖≥16.67 mmol/L為DM造模成功[5]，不成功的再次空腹12 h后注射1%的STZ溶液10 mg/kg。

1.2.2DU模型的建立 維持高血糖狀態(tài)4周后，兩組腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉成功后背部脫毛，常規(guī)消毒；在背部用打孔器制作直徑約2.5 cm的圓形創(chuàng)面，深至皮下[6]。DU造模時(shí)兩組各死亡1只。將剩余大鼠各取15只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3創(chuàng)面愈合情況觀察DU造模后第0、3、7、14天，觀察創(chuàng)面顏色、腫脹程度、滲液量等；用數(shù)碼相機(jī)拍照，通過Photoshop軟件記算創(chuàng)面面積[7]。創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積-給藥后第n天創(chuàng)面面積)/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.2.4創(chuàng)面組織病理觀察分別于DU造模后第3、7、14 天，每組各隨機(jī)抽取5只；戊巴比妥鈉麻醉成功后，采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm的組織；4%多聚甲醛固定后，常規(guī)制成組織切片；將石蠟切片脫蠟、水化后，行HE染色，觀察創(chuàng)面組織病理變化。

2結(jié)果

2.1兩組DU造模后不同時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較見表1。

表1　兩組DU造模后不同時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2兩組創(chuàng)面組織病理變化在DU造模第3天，對照組創(chuàng)面可見炎癥細(xì)胞浸潤明顯，有少量纖維母細(xì)胞及少量新生毛細(xì)血管；DM組創(chuàng)面有少量炎癥細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及新生毛細(xì)血管；第7 天，對照組創(chuàng)面可見肉芽組織，纖維母細(xì)胞生長活躍，新生毛細(xì)血管數(shù)量增加，有較多炎癥細(xì)胞及少量膠原纖維；DM組創(chuàng)面可見炎癥細(xì)胞浸潤，有少量纖維母細(xì)胞及新生毛細(xì)血管，少量膠原纖維；第14 天，對照組創(chuàng)面可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及毛細(xì)血管，可見較多膠原纖維；DM組創(chuàng)面可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及毛細(xì)血管，可見膠原纖維。

3討論

目前，DM動物造模主要有以下兩種辦法：一是采用STZ或四氧嘧啶大劑量注射，此法損傷大量胰腺細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌顯著下降，更傾向于1型DM的特點(diǎn)，且動物死亡率較高[8]。二是采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射[9，10]，高脂高糖喂養(yǎng)4周后大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖和胰島素抵抗，而后一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg可成功制備2型DM模型[11～13]。因此，本研究采用第二種方法進(jìn)行DM造模。

鐘清玲[14]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠DM造模成功4周后皮膚組織可出現(xiàn)病理性改變，而DM所致皮膚改變在DU的發(fā)生中有重要地位。陸樹良等[15]認(rèn)為，DM患者表皮組織在未損傷的情況下已經(jīng)存在組織學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，并將此改變稱為隱性損害，認(rèn)為這一隱性損害可能是DM皮膚易損或創(chuàng)面形成后難以愈合的重要原因之一。因此，維持DM大鼠高血糖4周后再行創(chuàng)面造模較之血糖升高后隨即造模更合理。本研究發(fā)現(xiàn)，維持高血糖4周后再行創(chuàng)面造模，DM組大鼠在造模后第3、7、14天創(chuàng)面愈合率均低于對照組，且創(chuàng)面組織的HE染色中表現(xiàn)出較少的炎性細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及新生毛細(xì)血管等，因此本實(shí)驗(yàn)成功完成了DM難愈性創(chuàng)面的造模。所以，高脂高糖飼料飼養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射制作T2DM模型，維持高血糖4周后采用外科方法制作潰瘍模型，可成功模型DM潰瘍的發(fā)病過程，并可作為DM難愈性創(chuàng)面的理想動物模型。

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(收稿日期：2015-12-21)

中圖分類號：R332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0031-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.010

通信作者：劉明(E-mail: liuming404@163.com)

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2012HL14)；山東省濟(jì)南市青年科技明星計(jì)劃(20120145)。