李九席，焦紅軍，任明(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450001)

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銀杏葉提取物對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響及其機(jī)制探討

李九席，焦紅軍，任明(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450001)

摘要：目的觀察銀杏葉提取物(GBE)對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙及腦組織相關(guān)因子的影響，探討GBE改善糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機(jī)制。方法選擇健康SD雄性大鼠72只，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組、低劑量組、中劑量組及高劑量組各12只。除正常組外，其余各組均行腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型。造模后，低、中、高劑量組分別予GBE 0.44、0.88、1.75 mg/kg腹腔注射，陽(yáng)性組灌胃培磊能0.4 mg/kg，正常組、模型組予等體積生理鹽水腹腔注射，各組均連續(xù)干預(yù)12周。采用八臂迷宮法觀察各組第1、5天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)，采用跳臺(tái)法觀察各組跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)，評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能的變化。取各組腦組織，采用ELISA法測(cè)定各組腦組織TNF-α、IL-1β、乙酰膽堿酯酶(AChE)蛋白表達(dá)量。結(jié)果模型組第1、5天的換臂后錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常組(P均<0.01)。陽(yáng)性組、低劑量組、中劑量組及高劑量組第1天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)均低于模型組(P均<0.01)。中、高劑量組第5天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)低于模型組(P均<0. 05)。模型組跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常組(P均<0.01)。與模型組對(duì)比，其余各組跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均減少(P均<0.05)。模型組腦組織TNF-α、IL-1β、AChE水平均高于正常組(P均<0.01)。與模型組比較，低劑量組、中劑量組及高劑量組腦組織TNF-α、IL-1β及AChE水平均降低(P<0.01或0.05)。結(jié)論GBE對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有較好的防治作用，其機(jī)制可能與降低腦組織中TNF-α、IL-1β及AChE水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；銀杏葉提取物；學(xué)習(xí)記憶功能障礙；腦血流量;大鼠

糖尿病腦病是老年糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致反應(yīng)遲鈍、記憶力下降等學(xué)習(xí)記憶功能障礙，重者可出現(xiàn)老年癡呆等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌不足或高胰島素血癥均可通過(guò)影響大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)，從而對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能造成不良影響[2～4]。銀杏葉提取物(GBE)是學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)劑，主要藥理成分為總黃酮類、銀杏內(nèi)酯等，常被應(yīng)用于老年神經(jīng)精神癥狀、腦動(dòng)脈硬化、腦梗死后遺癥等的治療[5]。目前對(duì)GBE在糖尿病患者學(xué)習(xí)記憶功能障礙治療中的應(yīng)用報(bào)道較少，對(duì)其機(jī)制尚不明確。2014年5月～2015年4月，我們對(duì)2型糖尿病大鼠應(yīng)用GBE治療，觀察GBE對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑健康SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)別，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(豫)2012A052。GBE注射液(商品名金納多，含總黃酮醇甙4.2 mg、銀杏內(nèi)酯A 0.30 mg)；甲磺酸二氫麥角堿緩釋膠囊(商品名培磊能)。鏈脲佐菌素(STZ)由美國(guó) Sigma 公司提供；大鼠TNF-α、IL-1β、乙酰膽堿酯酶(AChE)ELISA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2分組及模型制備將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組各12只。除正常組外，其余各組均行腹腔內(nèi)注射STZ 50 mg/kg建立糖尿病模型[6]。72 h后，取大鼠尾靜脈血，測(cè)定血糖、尿糖，以血糖≥16. 7 mmol/L、尿糖>(+++)為造模成功。各組造模均成功。

1.3干預(yù)方法造模后，低、中、高劑量組分別予GBE 0.44、0.88、1.75 mg/kg腹腔注射，陽(yáng)性組灌胃培磊能0.4 mg/kg，正常組、模型組予等體積生理鹽水腹腔注射，給藥容量均為10 mg/kg，均連續(xù)干預(yù)12周。

1.4學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試采用八臂迷宮法[7]觀察各組第1、5天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)，評(píng)價(jià)大鼠的行為學(xué)習(xí)記憶功能，達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤次數(shù)2次以下(不包括2次)。采用跳臺(tái)法[8]觀察各組跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)，評(píng)價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。

1.5腦組織IL-1β、TNF-α及AChE表達(dá)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試后，斷頭處死大鼠，快速取腦組織，用預(yù)冷的生理鹽水制成10%腦組織，采用ELISA法測(cè)定各組腦組織TNF-α、IL-1β、AChE蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

2.1各組換臂后錯(cuò)誤次數(shù)比較模型組第1、5天的換臂后錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常組(P均<0.01)。陽(yáng)性組、低劑量組、中劑量組及高劑量組第1天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)均低于模型組(P均<0.01)。中、高劑量組第5天換臂后錯(cuò)誤次數(shù)低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組換臂后錯(cuò)誤次數(shù)比較(次，±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2各組跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)比較模型組跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常組(P均<0.01)。與模型組對(duì)比，其余各組跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均減少(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)比較(次，±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3各組腦組織TNF-α、IL-1β、AChE蛋白表達(dá)比較模型組腦組織TNF-α、IL-1β、AChE水平均高于正常組(P均<0.01)。與模型組比較，低劑量組、中劑量組及高劑量組腦組織TNF-α、IL-1β及AChE水平均降低(P<0.01或0.05)。見(jiàn)表3。

3討論

大腦處理信息的能力與腦血流量有關(guān)，腦血流量降低可明顯影響學(xué)習(xí)記憶功能[9,10]。學(xué)習(xí)記憶功能障礙主要表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶功能紊亂，尤其是學(xué)習(xí)和記憶能力的降低，是誘發(fā)老年性癡呆的主要危險(xiǎn)因素之一。糖尿病患者常伴有學(xué)習(xí)記憶功能障礙，并隨著高血糖持續(xù)而加重，且不易恢復(fù)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的學(xué)習(xí)記憶障礙與腦血流降低有關(guān)。持續(xù)的高血糖可導(dǎo)致毛細(xì)血管基底膜增厚，導(dǎo)致管腔狹窄，使腦血流量降低。此外，糖尿病患者常伴有脂代謝紊亂，加重了血液黏稠度，減慢了血流循環(huán)，也從一定程度上降低了腦血流量[12]。因此，增加腦血流量、改善腦組織供血可促進(jìn)腦部血流循環(huán)，改善腦部功能，對(duì)于學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有明顯的改善作用。

表3　　　　各組腦組織TNF-α、IL-1β、AChE蛋白

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與陽(yáng)性組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

GBE是銀杏科植物銀杏的干燥葉提取物，富含多種活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、清除自由基等多種藥理作用，對(duì)于記憶功能障礙具有良好的療效[13]。除可調(diào)節(jié)血糖、改善胰島素抵抗外，GBE可增加腦血流量，調(diào)節(jié)血管張力和彈力，促進(jìn)血液循環(huán)，抑制血小板黏附，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞不受損傷，可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)?？傸S酮醇甙、白果內(nèi)酯等萜烯是銀杏的活性成分，具有抗氧化、清除自由基作用，能清除大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的自由基，發(fā)揮抗氧化作用，有助于防止大腦功能減退[14]。

八臂迷宮法是通過(guò)行為學(xué)習(xí)記憶對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試的方法，以換臂后錯(cuò)誤次數(shù)評(píng)價(jià)大鼠的行為學(xué)習(xí)記憶功能。錯(cuò)誤次數(shù)越多，說(shuō)明大鼠的行為學(xué)習(xí)記憶功能越弱，其中第1天反映大鼠對(duì)行為的學(xué)習(xí)能力，第5天反映大鼠對(duì)行為的記憶能力。跳臺(tái)法是通過(guò)空間學(xué)習(xí)記憶對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)試的方法，以跳下平臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)評(píng)價(jià)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，錯(cuò)誤次數(shù)越多，說(shuō)明大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能越弱。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組換臂后錯(cuò)誤次數(shù)、跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均高于正常組，提示糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能降低，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙；中、高劑量組換臂后錯(cuò)誤次數(shù)、跳下平臺(tái)學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)均低于正常組、模型組，提示中、高劑量組大鼠的行為、空間學(xué)習(xí)記憶功能得到明顯改善，表明GBE能提高糖尿病大鼠對(duì)行為、空間的學(xué)習(xí)記憶能力，改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)可能是造成學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)制之一。TNF-α是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性的細(xì)胞因子。IL-1β是白細(xì)胞介素家族成員之一，參與免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程。IL-1β、TNF-α均是與缺血有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要炎癥因子，可通過(guò)不同的途徑促進(jìn)神經(jīng)組織的炎性反應(yīng)，損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，腦部受損的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量的TNF-α、IL-1β等生物活性因子，這些生物活性因子可反饋性地加重小膠質(zhì)細(xì)胞的活化效應(yīng)，加重神經(jīng)元損傷，并抑制神經(jīng)元突觸產(chǎn)生的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，導(dǎo)致認(rèn)知障礙[15]。

中樞膽堿能通路是大腦學(xué)習(xí)記憶的主要通路，乙酰膽堿是其神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦學(xué)習(xí)記憶方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[16]。AChE具有羧肽酶和氨肽酶的活性，參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。神經(jīng)損傷和再生是非常復(fù)雜的過(guò)程，受許多內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)和影響。在神經(jīng)損傷的早期，AchE在神經(jīng)元胞體和近端軸突內(nèi)的活性增強(qiáng)，可促進(jìn)神經(jīng)再生，不僅參與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，還具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)神經(jīng)組織的發(fā)育和神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦組織TNF-α、IL-1β及AChE水平均高于正常組，提示糖尿病大鼠腦組織存在炎癥反應(yīng)，中樞膽堿能通路激活，AChE水平升高，可能與學(xué)習(xí)記憶功能障礙的發(fā)生有關(guān)；低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β及AChE均低于模型組，提示GBE能顯著降低腦組織中的IL-1β、TNF-α及AChE，減少炎癥反應(yīng)，抑制AchE活性，提高腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，進(jìn)而改善中樞膽堿能系統(tǒng)功能、改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙；與陽(yáng)性組比較，低、中劑量組腦組織TNF-α、IL-1β及AChE仍較高，而高劑量組腦組織TNF-α、IL-1β及AChE與陽(yáng)性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示對(duì)于降低糖尿病大鼠腦組織TNF-α、IL-1β及AChE水平方面，銀杏葉提取物用量需要達(dá)到一定的劑量才能發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用。

綜上所述，GBE對(duì)糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有較好的防治作用，其機(jī)制可能與降低腦組織中的TNF-α、IL-1β及AChE有關(guān)。

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(收稿日期：2015-10-28)

中圖分類號(hào)：R749.1；R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)14-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.009

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A350014)。