李青，鄧琦，趙明峰，李玉明(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300070；天津市第一中心醫(yī)院)

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利妥昔單抗對(duì)CIK細(xì)胞殺傷活性及細(xì)胞毒作用的影響

李青1,2，鄧琦2，趙明峰2，李玉明2(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300070；2天津市第一中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察利妥昔單抗對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞殺傷活性及細(xì)胞毒作用的影響，為利妥昔單抗的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法取15例健康供者外周血制備CIK細(xì)胞，分為對(duì)照組、觀察1組、觀察2組。觀察1組、觀察2組分別加入5×104、10×104 μg/L的利妥昔單抗，對(duì)照組不加入利妥昔單抗。干預(yù)第14天時(shí)，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表達(dá)，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)水平，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D(CD314)及CIK細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)。將每組CIK細(xì)胞復(fù)設(shè)3孔，分別與髓系白血病細(xì)胞株K562和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL2以10∶1、20∶1、40∶1共培養(yǎng)，采用MTT法測(cè)定各組對(duì)K562細(xì)胞及SU-DHL2細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果各組CD3+、CD3+CD56+表型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。觀察1組、觀察2組細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)。觀察1組、觀察2組CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)均高于對(duì)照組(P均<0.05)。各組CIK細(xì)胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時(shí)對(duì)K562細(xì)胞、SU-DHL2細(xì)胞的殺傷活性均高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論利妥昔單抗可增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)髓系白血病細(xì)胞及B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞均具有細(xì)胞毒作用。

關(guān)鍵詞：利妥昔單抗；細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞；白血??；淋巴瘤

急性白血病(AL)完全緩解后體內(nèi)的殘留病灶是導(dǎo)致AL復(fù)發(fā)的根源。利用具有殺傷腫瘤細(xì)胞活性的免疫活性細(xì)胞清除AL殘留病灶，是預(yù)防AL復(fù)發(fā)的重要方法。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞是一組CD3+CD56+細(xì)胞，同時(shí)具有T細(xì)胞的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性殺瘤特點(diǎn)，是目前血液腫瘤生物免疫治療中應(yīng)用最廣泛、最具有發(fā)展前景的細(xì)胞之一[1]。CIK細(xì)胞可分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、IL-2等具有細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞因子，其細(xì)胞表面活化性受體NKG2D(CD314)也具有殺傷活性。如何提高CIK細(xì)胞的殺瘤活性是提高其臨床應(yīng)用效果的必要前提。利妥昔單抗是人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體，對(duì)于B細(xì)胞淋巴瘤具有較好的療效[2～5]。目前，對(duì)利妥昔單抗是否可影響CIK細(xì)胞對(duì)AL細(xì)胞的殺傷能力尚不明確。2014年10月～2015年10月，我們應(yīng)用利妥昔單抗干預(yù)CIK細(xì)胞，觀察對(duì)CIK細(xì)胞的殺傷活性及細(xì)胞毒作用的影響，為利妥昔單抗的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑髓系白血病細(xì)胞株K562和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL2為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)、IFN-γ購(gòu)自北京四環(huán)生物制藥公司；CD3單克隆抗體購(gòu)自北京同立海源生物科技有限公司；利妥昔單抗購(gòu)自上海羅氏制藥公司；FITC標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD56及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BD公司；PE標(biāo)記NKG2D(CD314)購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；PE標(biāo)記穿孔素、顆粒酶B購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。

1.2外周血CIK細(xì)胞制備取15例健康供者外周血各20 mL，作為體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞來(lái)源。肝素抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液(含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL備用。

1.3分組及干預(yù)方法取6孔培養(yǎng)板，將CIK細(xì)胞以1×106/孔培養(yǎng)，分為對(duì)照組、觀察1組、觀察2組。各組加入1×106U/L的IFN-γ后，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后再加入1×106U/L的IL-2、50 μg/L的CD3單抗，觀察1組、觀察2組再分別加入5×104、10×104μg/L的利妥昔單抗。對(duì)照組不加入利妥昔單抗干預(yù)。

1.4CIK細(xì)胞表型檢測(cè)干預(yù)第14天時(shí)收集2×105個(gè)細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表達(dá)，評(píng)價(jià)利妥昔單抗干預(yù)后CIK細(xì)胞表型的變化。

1.5細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平檢測(cè)干預(yù)第14天時(shí)取各組上清，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上清液中TNF-α、IFN-γ水平，評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞分泌具有殺傷效應(yīng)細(xì)胞因子的功能。

1.6CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素檢測(cè)干預(yù)第14天時(shí)，收集2×105個(gè)細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞表面CD314的表達(dá)，檢測(cè)CIK細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)，評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞的殺傷活性。

1.7細(xì)胞毒作用觀察采用MTT法。取96孔培養(yǎng)板，將每組CIK細(xì)胞復(fù)設(shè)3孔，分別與K562細(xì)胞以10∶1、20∶1、40∶1進(jìn)行共培養(yǎng)，另設(shè)CIK細(xì)胞對(duì)照孔、K562細(xì)胞(靶細(xì)胞)對(duì)照孔。同法處理SU-DHL2細(xì)胞。孵育72 h后，離心去上清，加入MTT試劑20 μL(50 g/L)，加入二甲基亞砜150 μL，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(波長(zhǎng)570 nm)檢測(cè)吸光度(OD)值，重復(fù)測(cè)3次取均值,計(jì)算殺傷活性。殺傷活性(%)=[1-(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD細(xì)胞對(duì)照孔)/OD靶細(xì)胞對(duì)照孔]×100%。

2結(jié)果

2.1各組CIK細(xì)胞CD3+、CD3+CD56+表達(dá)比較各組CD3+、CD3+CD56+表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組CIK細(xì)胞CD3+、CD3+CD56+表達(dá)比較

2.2各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平比較觀察1組、觀察2組細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組細(xì)胞上清液TNF-α、IFN-γ水平比較(ng/L)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3各組CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素表達(dá)比較觀察1組、觀察2組CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　　　　各組CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4各組CIK細(xì)胞對(duì)K562、SU-DHL2細(xì)胞的殺傷活性比較各組CIK細(xì)胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時(shí)對(duì)K562細(xì)胞、SU-DHL2細(xì)胞的殺傷活性均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表4、5。

表4　各組CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表5　　　　各組CIK細(xì)胞對(duì)SU-DHL2細(xì)胞殺傷活性

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3討論

AL和惡性淋巴瘤復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療失敗及患者死亡的根本原因，清除殘存的腫瘤細(xì)胞是患者緩解后治療的主要目的。CIK細(xì)胞在體外及體內(nèi)均具有良好的抗腫瘤活性，廣泛應(yīng)用于生物免疫治療領(lǐng)域。但血液系統(tǒng)腫瘤由于存在免疫編輯作用，加之多療程化療對(duì)患者正常T細(xì)胞功能存在抑制作用，可導(dǎo)致患者的CIK細(xì)胞增殖能力及殺傷效應(yīng)降低[6,7]，進(jìn)而影響生物治療的效果。血液腫瘤患者的CIK細(xì)胞活性降低與腫瘤早期復(fù)發(fā)相關(guān)，因此，提高CIK細(xì)胞殺傷效應(yīng)可提高生物免疫治療的效果，更好地清除殘留病灶、預(yù)防復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存期。

利妥昔單抗是以基因工程研制的高純度部分可變區(qū)(R)為鼠源，其他部分和恒定區(qū)為人源的人鼠嵌合型單克隆抗體，其主要靶點(diǎn)為B細(xì)胞表面CD20抗原，廣泛應(yīng)用于B細(xì)胞淋巴瘤的治療。利妥昔單抗可與B細(xì)胞的CD20抗原結(jié)合，直接誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞瘤凋亡，其機(jī)制可能為通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)(ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。此外，利妥昔單抗可通過(guò)ADCC效應(yīng)促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等釋放穿孔素、顆粒酶B、TNF-α等，發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞作用。但利妥昔單抗是否可增強(qiáng)CIK細(xì)胞的活性尚不清楚。CD3+CD56+是CIK細(xì)胞的表型，對(duì)于殺傷作用的發(fā)揮具有主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，各組CIK細(xì)胞CD3+、CD3+CD56+表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示利妥昔單抗干預(yù)CIK細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的表型無(wú)明顯影響，仍保留CIK細(xì)胞的殺傷作用。

CIK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子。CIK細(xì)胞分泌的TNF-α、IFN-γ不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組、觀察2組細(xì)胞上清液TNF-α、IFN-γ水平均高于對(duì)照組，提示利妥昔單抗干預(yù)CIK細(xì)胞后，可增加CIK細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的功能，從而增強(qiáng)CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用。

CD314是介導(dǎo)CIK細(xì)胞殺傷活性的主要活化性受體，也是腫瘤細(xì)胞與CIK細(xì)胞發(fā)生免疫編輯的靶點(diǎn)[11,12]。腫瘤患者體內(nèi)的CIK細(xì)胞受腫瘤細(xì)胞的編輯，使表面活化性受體CD314表達(dá)下降，導(dǎo)致CIK細(xì)胞的殺傷活性降低。顆粒酶B、穿孔素存在于CIK細(xì)胞的胞質(zhì)中，是細(xì)胞毒效應(yīng)分子，可直接活化凋亡蛋白酶進(jìn)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。此外，顆粒酶B還可以通過(guò)甘露糖-6磷酸受體介導(dǎo)的胞吞作用攝入靶細(xì)胞，經(jīng)穿孔素作用破壞靶細(xì)胞的核內(nèi)膜，進(jìn)而通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，是CIK細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的主要效應(yīng)分子[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組、觀察2組CIK細(xì)胞表面CD314及細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)均高于對(duì)照組，提示利妥昔單抗增加了CIK細(xì)胞表面CD314的表達(dá)，增加了細(xì)胞中顆粒酶B、穿孔素的釋放，從而增強(qiáng)了殺傷活性，可能與利妥昔單抗抑制CIK細(xì)胞的免疫編輯作用有關(guān)。

利妥昔單抗作為B細(xì)胞表面標(biāo)志物CD20的單克隆抗體，對(duì)于B細(xì)胞淋巴瘤的治療具有特異性效果。本研究發(fā)現(xiàn)，各組CIK細(xì)胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時(shí)對(duì)SU-DHL2細(xì)胞的殺傷活性均高于對(duì)照組，提示利妥昔單抗干預(yù)CIK細(xì)胞后，提高了對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的殺傷活性，可能與利妥昔單抗的直接殺傷作用有關(guān)，也可能與利妥昔單抗提高CIK細(xì)胞的殺傷活性有關(guān)；各組CIK細(xì)胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時(shí)對(duì)K562的殺傷活性也高于對(duì)照組，提示雖K562細(xì)胞表面CD20抗原表達(dá)較低，但CIK細(xì)胞對(duì)其的殺傷作用仍增強(qiáng)，考慮雖利妥昔單抗是抗CD20單抗，也可增強(qiáng)對(duì)不具有CD20抗原的髓系白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，表明利妥昔單抗既可以殺傷髓系白血病細(xì)胞，也可以殺傷B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，可能不僅通過(guò)CD20靶點(diǎn)發(fā)揮作用，也可能與增強(qiáng)CIK細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素等從而增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷活性有關(guān)。

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Effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer cells

LIqing1,DENGQi,ZHAOMingfeng,LIYuming

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer (CIK) cells and to provide basis for the clinical application of rituximab.MethodsCIK cells from peripheral blood of healthy donors were prepared and then were divided into the control group, observation group 1 and observation group 2. The observation group 1 and observation group 2 were respectively added with 5×104, 10×104 μg/L rituximab and the control group was not treated. On day 14, the expression of CD3+, CD3+CD56+ was analyzed by flow cytometry, the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon γ (INF-γ) were detected by enzyme-linked immunosorbent method, and the expression of CD314, granzyme B and perforin in the CIK cells of the three groups was detected by flow cytometry. In the three groups, three holes of CIK cells were reset to co-culture with K562 cells and SU-DHL2 cells with the ratios of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1), and then the cytotoxicity of the CIK cells against K562 or SU-DHL2 cell lines were measured using MTT. Results The phenotypes of CD3+, CD3+CD56+ had no statistical difference among these three groups (P>0.05). The levels of INF-γ and TNF-α in the supernatant of the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (P<0.05). The expression of CD314, granzyme B and perforin in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). Cytotoxicity against SU-DHL4 or K562 cells at different ratio of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1) in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). ConclusionRituximab can improve the killing activity of CIK cells and has cytotoxic effect on the myeloid leukemia cells and B-lymphoma cells.

Key words:rituximab; cytokine-induced killer cells; leukemia; lymphoma

(收稿日期：2015-12-09)

中圖分類號(hào)：R733.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)14-0021-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.007

通信作者簡(jiǎn)介：趙明峰(1971-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫及造血調(diào)控。E-mail: zmfzmf@hotmail.com

第一作者簡(jiǎn)介：李青(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閻盒匝翰∠到y(tǒng)診治。E-mail: 15522388022@163.com

基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目(2014KZ021)；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(13KG106)。