單增天，吳愛花，田岳鳳，李雷勇，王 軍

（1.山西中醫(yī)學院，山西太原030024； 2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001）

實Expe驗rim en中tal S醫(yī)tudy藥 on T學CM

不同灸法對免疫抑制兔T細胞亞群、NK細胞、B細胞的影響

單增天1，吳愛花1，田岳鳳1，李雷勇2，王 軍1

（1.山西中醫(yī)學院，山西太原030024； 2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001）

“實驗”雖然是現(xiàn)代科學研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實驗也”，顏之推說“昔在江南，不信有千人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實驗也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學并非只是經驗之學，而更充滿實驗的思想和方法。實驗中醫(yī)藥學，將現(xiàn)代實驗科學的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學的實驗方法融合起來，開拓現(xiàn)代實驗生物學、醫(yī)學和藥物科學的新領域。

目的：觀察不同灸法對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔T細胞亞群、NK細胞、B細胞的影響。方法：將大耳白兔50只隨機分成5組，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組、假藥餅灸組。除空白組外，其他4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)造模7 d，造成免疫抑制模型。3個治療組分別給予隔藥餅灸、艾灸、假藥餅灸治療，隔日灸，共灸10次。治療結束次日靜脈取血，ELISA法檢測CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、B細胞值。結果：與空白組比較，模型組CD3+明顯降低、CD8+明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，隔藥餅灸組CD3+升高、CD8+降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；艾灸組和假藥餅組CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞及B細胞值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：隔藥餅灸能有效地調節(jié)因環(huán)磷酰胺所致的CD3+下降、CD8+升高。

環(huán)磷酰胺；免疫抑制；隔藥餅灸；T細胞亞群；NK細胞；B細胞

艾灸在我國已有兩千多年的歷史，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要部分。大量實驗研究證實艾灸能夠有效地調節(jié)機體免疫力，使處于免疫抑制狀態(tài)的機體恢復正常狀態(tài)。隔藥餅灸是將藥物、艾灸、穴位三者有機結合作用于機體，本文從這一角度研究隔藥餅灸對免疫抑制兔機體T細胞亞群、NK細胞、B細胞的影響，并與艾灸組及假藥餅組相比較，為艾灸提高機體免疫力低下提供明確的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 50只大耳白兔來自北京昌揚西山養(yǎng)殖場［動物合格證號：SCXK（京）2011-0010］，體質量（2.5±0.3）kg，雌雄不限。飼養(yǎng)溫度和濕度分別為20℃～25℃、50%～70%。

1.1.2 藥物與試劑 清艾條：江蘇盱眙華佗中藥廠（批號：Z32020153）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX）：200mg/瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號：H14023686）；0.9%NaCl注射液500mL：石家莊四藥有限公司。酶聯(lián)免疫試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 將50只大耳白兔隨機分為5個組，每組10只，分別為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組和假藥餅灸組。造模前實驗動物適應性飼養(yǎng)1 w，除空白組外其余4組均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg（環(huán)磷酰胺用0.9%NaCl注射液稀釋），每天上午注射給藥，連續(xù)7 d，制造免疫抑制模型，空白組注射等量0.9%NaCl注射液。

1.2.2 穴位選擇 神闕、關元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）。穴位定位參照林文注主編《實驗針灸學》［1］常用動物穴位定位法及擬人比照法。

1.2.3 藥物制作 按六味地黃丸組方劑量將熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓打碎成粉末，過120目篩備用，用75%酒精將藥物粉末調勻制作藥餅，藥餅均用模具制成，直徑1 cm，厚0.3 cm；假藥餅原料采用面粉，制作方法與藥餅相同。

1.2.4 施灸方法 施灸前將動物穴位處皮毛剪去，將其固定于兔臺。將江蘇盱眙華佗中藥廠的清艾條折斷，取出艾絨，制成大小相等，底徑0.8 cm、高0.5 cm的圓錐形艾柱，置于藥餅和假藥餅上，以線香點燃，燃盡更換，每穴連灸3壯，隔日灸，共灸10次；艾灸組將3壯艾柱量的艾絨制作成小艾條，置于穴位上施灸。隔日灸，共灸10次。

1.3 樣品采集及指標觀察

治療結束次日，動物麻醉，取腹腔靜脈血，離心，抽取血清備用。ELISA法檢測：CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、B細胞值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

與空白組比較，模型組、假藥餅組CD3+明顯降低、CD8+明顯升高，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CD4+、NK、B細胞3項指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組CD3+升高、CD8+降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果見表1。

3 討論

環(huán)磷酰胺可殺傷淋巴細胞，尤其對早期NK細胞有明顯抑制作用；T、B細胞是重要的淋巴細胞，對環(huán)磷酰胺也最為敏感，可抑制T淋巴細胞轉化成淋巴母細胞，抑制B細胞的特異性抗體反應。大量動物實驗研究證明，環(huán)磷酰胺是一種常用的免疫抑制劑，對動物機體可產生中等至嚴重的免疫抑制作用，抑制機體的體液免疫和細胞免疫反應，造成免疫功能的低下［2-3］。因此，在實驗研究中常利用這一作用制作免疫抑制模型。環(huán)磷酰胺是一種強免疫抑制劑，主要免疫抑制機制為：可殺傷淋巴細胞，尤其早期對B細胞、NK細胞作用明顯；抑制T淋巴細胞對抗原刺激后的淋巴母細胞轉化；抑制B細胞的特異性抗體反應［4］。CD3+、CD8+、NK細胞等都是免疫細胞中重要的檢測指標。T淋巴細胞主要參與細胞免疫，CD3+是成熟T細胞的表面標志，其數(shù)量代表細胞免疫的總體水平；CD4+主要表達于輔助T細胞，CD8+表達于細胞毒性T細胞上，二者對免疫功能的判斷有重要作用。NK細胞是機體重要的一類免疫細胞，參與機體免疫調節(jié)和自身免疫性疾病。B細胞是體內唯一能產生抗體的細胞，外周血B細胞約占淋巴細胞總數(shù)的10%～20%，在機體內發(fā)揮體液免疫功能。

表1 不同灸法對免疫抑制兔血清CD、NK及B的影響 （±s）

表1 不同灸法對免疫抑制兔血清CD、NK及B的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與空白組比較，2）P＜0.01

組別 n CD3+（U/ml）CD4+（U/ml）CD8+（U/ml）NK（nmol/L） Bc（ng/L）空白組 10 42.48±4.52 23.61±0.90 8.94±1.47 84.79±10.64 587.00±117.81模型組 10 32.00±8.322）23.37±2.25 10.76±1.082）92.21±10.60 632.67±140.81隔藥餅組 10 42.73±4.721）23.76±1.53 9.01±0.661）91.47±16.21 647.00±108.07艾灸組 10 39.79±5.40 23.70±3.16 9.67±1.51 91.76±21.84 704.59±213.95假藥餅組 10 32.48±11.772）24.49±2.23 10.52±1.332）88.16±10.04 660.19±149.20 F值 4.80 0.36 4.31 0.47 0.77 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

神闕與關元均為任脈上穴位，神闕穴可健脾和胃、強壯保健、祛病延年，關元穴培補元氣；足三里為足陽明胃經之合穴，根據《內經》“合治內腑”的理論，凡六腑之病皆可用之，具有理脾胃、調氣血、補虛損之功效，灸足三里，可強身健體，延緩衰老；脾俞、腎俞為脾腎兩臟之背俞穴，氣血匯聚于此，長灸之可健脾益氣、滋陰補腎。研究表明，艾灸足三里穴、關元穴通過增加NK、NKT細胞數(shù)量，改善訓練小鼠的細胞免疫功能［5］。早期研究發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸健康老年人大椎等穴，發(fā)現(xiàn)艾灸組T細胞亞群比例得到調整，CD3+、CD4+百分率增高，CD4+/CD8+比率也隨之升高，治療前后差異有顯著意義［6］。艾灸督脈穴可延緩胸腺和脾臟的萎縮和退化，糾正T細胞亞群比例失衡的狀態(tài)［7］。

六味地黃丸為滋補腎陰的經典名方，方中重用熟地黃為君藥，滋陰補腎、填精益髓，有大補真陰之功效；用補肝養(yǎng)腎而澀精的山萸肉和健脾固腎而固精的山藥為臣藥，三味補藥相配伍有滋腎、養(yǎng)肝、益脾的作用；佐以澤瀉利水滲濕、瀉腎火，防熟地之滋膩戀邪；丹皮清瀉相火，涼肝而瀉陰中伏火，制山萸肉之溫澀；茯苓滲濕健脾，既助山藥補脾，又助澤瀉利水，且防熟地滋膩有礙脾胃運化。六味地黃丸是中醫(yī)滋補腎陰的代表方，臨床既可增強機體免疫力，又可抑制免疫反應［8］。六味地黃湯對神經內分泌免疫調節(jié)網絡具有調節(jié)和恢復平衡的作用，從湯劑中逐步分離獲得免疫活性部位CA4，再分離純化得到CA4-3，其是免疫活性多糖，B細胞是其直接作用的主要靶細胞之一，表明六味地黃湯中的酸性多糖是該復方發(fā)揮免疫調節(jié)作用的重要物質基礎之一［9］。六味地黃軟膠囊可改善環(huán)磷酰胺致成年及幼年小鼠免疫功能低下，表現(xiàn)在改善T細胞增殖能力，提高T細胞數(shù)量，尤其是CD8+細胞，明顯提高脾細胞天然殺傷活性，能明顯降低遲發(fā)型超敏反應等。說明六味地黃軟膠囊能增強機體的防御功能，抵御外邪入侵［10］。藥理研究證實，它可通過調節(jié)T細胞亞群、NK細胞、B細胞的功能，從而改善機體免疫功能［11］。

隔藥餅灸是臨床常用灸法之一，是將中藥與艾灸有機結合的一種方法，具有艾灸、藥物、腧穴三重效應，通過艾灸的溫熱作用促進皮膚對滋陰補腎藥物的吸收，經經絡傳輸從而發(fā)揮藥物歸經之效能。我們十余年的臨床研究結果充分表明隔藥餅灸對機體免疫功能的良好調節(jié)作用［12-13］。

本實驗結果表明，造模后CD3+明顯低于空白組、CD8+明顯高于空白組（P＜0.01），表明腹腔注射環(huán)磷酰胺造模成功。隔藥餅灸神闕、關元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙）后，免疫抑制兔血清中CD3+含量明顯回升，CD8+含量明顯降低，表明隔藥餅灸通過調節(jié)CD3+、CD8+含量達到提高免疫抑制兔的免疫功能。艾灸組、假藥餅灸組與模型組比較各項指標差異無統(tǒng)計學意義，說明艾灸組、假藥餅灸治療效果不佳。然而不同灸法對CD4+、NK細胞、B細胞3項指標無明顯影響，同時，艾灸組的變化也不明顯，出現(xiàn)這一問題是與艾灸量有關？還是樣本含量不夠大？這將是我們下一步研究的重點內容。

［1］林文注，王佩.實驗針灸學［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1994：283-287.

［2］周立峰，邱玉華，程鋼，等.圣愈湯對環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠T細胞亞群和細胞因子的影響［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學，2009，21（8）：808-810.

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（編輯：張世霞）

Effect of differentmoxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits

Shan Zengtian1，Wu Aihua1，Tian Yuefeng1，Li Leiyong2，Wang Jun1
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi030001）

Objective：To observe the effect of different moxibustion on T cell subsets，NK cells and B cells in immunosuppressive rabbits induced by cyclophosphamide.Methods：50 rabbits were random ly divided into blank group，model group，cake-separated moxibustion group，moxibustion group，counterfeitmoxibustion group with 10 in each group.In addition to the blank group，the other groupswere injected with cyclophosphamide（60mg/kg）for sequential 7 days tomake immunosuppression model.Cake-separated moxibustion group，moxibustion group and counterfeitmoxibustion group were given moxibustion 10 times respectively once every other day.Venous blood was taken from the next day after treatment and CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells of serum were tested by ELISA.Results：Compared with blank group，CD3+was significantly decreased（P＜0.01）and CD8+was apparently increased（P＜0.01）in model group.Compared with model group，CD3+was significantly increased（P＜0.01）and CD8+was apparently decreased（P＜0.01）.in cake-separated moxibustion group the difference in CD3+，CD4+，CD8+，NK cells，B cells betweenmoxibustion group and counterfeitmoxibustion group was not statistical significance.Conclusions：Cake-separated moxibustion can effectively regulate CD3+，CD8+level induced by cyclophosphamide.

cyclophosphamide；immunosuppression；cake-separated moxibustion；T cell subsets；NK cells；B cells

R285

A

1671-0258（2016）01-0016-03

國家自然科學基金面上項目（81373742）

單增天，在讀碩士，E-mail：m13233639635_1@163.com

田岳鳳，教授，博士生導師，E-mail：tyfsx@163.com