施伎蟬 蔣賢高 余志杰 寧洪葉 何貴清 吳正興 蔡玉偉 程愛瓊

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應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性

施伎蟬 蔣賢高 余志杰 寧洪葉 何貴清 吳正興 蔡玉偉 程愛瓊

全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示，我國(guó)15歲以上人群活動(dòng)性、凃陽(yáng)和菌陽(yáng)肺結(jié)核的患病率分別為459/10萬、66/10萬和119/10萬，Mtb耐多藥率為6.8%[1]。近年來，流動(dòng)人口的增加、診斷治療的延誤和抗結(jié)核藥物的濫用等原因?qū)е履退幘甑脑黾?，造成耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的流行[2]。多重耐藥Mtb的出現(xiàn)、臨床缺乏有效的耐藥菌株檢測(cè)手段和尚無新的抗結(jié)核藥物出現(xiàn)等原因，使患者錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)，增加了耐藥菌株的傳染機(jī)會(huì)。因此，對(duì)Mtb的快速診斷及尋找有效的耐藥檢測(cè)方法成為了迫切的需求。

反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)是一種可以簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)基因突變和基因缺失的技術(shù)手段。本研究應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)溫州地區(qū)Mtb臨床分離菌株及其對(duì)4種一線抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)的基因突變(利福平耐藥基因rpoB、異煙肼耐藥基因katG和inhA、鏈霉素耐藥基因rpsL、乙胺丁醇耐藥基因embB)，并與液體培養(yǎng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探討其在檢測(cè)Mtb及耐藥性方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、患者來源

選取2013年11月至2014年10月在溫州市中心醫(yī)院感染科就診的93例門診和住院復(fù)治肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，其中男78例，女15例，平均年齡(48.0±12.5)歲。復(fù)治肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[3]，即：(1)初治失敗的患者；(2)規(guī)則用藥滿療程后痰菌復(fù)陽(yáng)的患者；(3)不規(guī)則化療超過1個(gè)月；(4)慢性排菌患者。有上述情況之一者確診為復(fù)治肺結(jié)核。

收集上述患者的痰標(biāo)本共計(jì)93份。留痰方法如下：(1)在留痰之前先用清水漱口數(shù)次，以清除口腔內(nèi)的食物殘?jiān)安糠蛛s菌。(2)留取的痰應(yīng)是用力咳嗽后自氣管內(nèi)咳出的痰，痰量不少于3 ml，然后盛于痰盒內(nèi)送檢。不要將唾液或鼻涕吐入痰盒，以免影響查痰結(jié)果。(3)留痰標(biāo)本要使用專用的痰盒，及時(shí)送到檢驗(yàn)科檢查。(4)門診就診患者，留取即時(shí)痰(就診當(dāng)時(shí)咳出的痰)2份，住院患者留取清晨痰(起床后深咳吐出的痰)2份。均分別送檢Mtb液體培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)與反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)。

二、試劑與儀器

Mtb耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司；朗基L96+/Y型PCR儀/基因擴(kuò)增儀，購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；羅氏診斷real-time PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)LC-480I和Z480)、FYY-3型分子雜交儀均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司；可調(diào)移液器(2～10 μl、20～200 μl)購(gòu)自德國(guó)艾本德公司；Fosun生物安全柜購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；顯色液新鮮配制，用時(shí)按所需濃度加蒸餾水配制。

三、方法

1.細(xì)菌培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)：所有痰標(biāo)本按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[4]進(jìn)行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。

2.DNA提?。禾禈?biāo)本1 ml加等量4% NaOH液化后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，混勻；離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，棄上清。向沉淀中加入50 ml細(xì)胞裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，留上清液進(jìn)行PCR。

3.膜芯片設(shè)計(jì)：經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)分析，設(shè)計(jì)23條特異性探針，并點(diǎn)樣至尼龍膜上，制成膜芯片。

4.PCR擴(kuò)增：取出PCR 反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，離心半徑8 cm，50 000 r/min離心2 min，加入已提取的待測(cè)樣品 DNA 4 μl。同時(shí)取兩管PCR反應(yīng)管分別加入陽(yáng)性標(biāo)本提取的DNA和陰性標(biāo)本提取的DNA，作為產(chǎn)品使用過程的質(zhì)量控制。反應(yīng)體系如下：模板DNA 20 ng、2.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，25 μmol/L上、下游引物各0.5 μl， DNA Taq酶2.5 U， 10×PCR緩沖液2.5 μl。使用ABI-7300儀器擴(kuò)增，循環(huán)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數(shù)為30；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數(shù)為30；68 ℃ 5 min。

5.反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)：取檢測(cè)膜條置15 ml離心管中，加5 ml雜交緩沖液(1×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基硫酸鈉) 和PCR 產(chǎn)物, 沸水浴10 min，58 ℃雜交2 h。將膜條移至裝有預(yù)熱洗液(0.5×檸檬酸鈉鹽、0.1% 十二烷基鈉)的50 ml管中，于58 ℃輕搖洗滌15 min。用雜交緩沖液配制1∶2000的過氧化物酶溶液，室溫輕搖泡膜30 min，棄過氧化物酶液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗膜2次，每次5 min。將膜條浸泡于新鮮配制的顯色液中(0. 1 mol/L檸檬酸鈉19 ml、2 mg/ml四甲基聯(lián)苯胺1 ml、3% H2O210 μl)，避光顯色5～10 min, 出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即為含有相應(yīng)的待檢基因。

6.結(jié)果判讀：陽(yáng)性質(zhì)控品正常顯色而臨床樣本只有第CC位點(diǎn)顯色，表明被檢樣本為陰性(即無Mtb)或者樣本中待檢測(cè)的Mtb在本試劑盒最低檢出限以下。膜條探針排列順序見圖1。

結(jié) 果

一、耐藥情況

在93份送檢液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)的痰標(biāo)本中，44份液體培養(yǎng)Mtb 陽(yáng)性，4份為非結(jié)核分枝桿菌，45份液體培養(yǎng)Mtb陰性。對(duì)44株Mtb菌株進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)，RFP耐藥15株，INH耐藥15株，EMB耐藥7株，Sm耐藥12株。38.6%(17/44)的Mtb菌株為耐藥菌株，其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的88.2%(15/17)(表1)。

二、反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

表1 44株Mtb菌株中不同耐藥類型的統(tǒng)計(jì)

93份痰標(biāo)本中，應(yīng)用反向斑點(diǎn)雜交法共檢出Mtb基因陽(yáng)性57份，陽(yáng)性檢出率為61.3%(57/93)，其中野生型32份，突變型25份，耐藥基因突變菌株占陽(yáng)性菌株的43.9%(25/57)。

N1●N2●N3●N4●N5●315N●?15N●CC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531LS531W315M?15M 543N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N●?15N●CC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M?15M 643N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5●315N●?15NCC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531LS531W315M?15M● 3843N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N?15N●CC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M●?15M 443N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N?15N●CC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M●?15M 5143N88N●306N●43M●88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N●?15NCC●編號(hào)D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M?15M● 343N88N●306N43M●88M306M1●306M2306M3Mtb

注 (1)第一排N代表該位點(diǎn)為野生型，第二排是突變位點(diǎn)，其中后2個(gè)探針的M代表突變探針。第一 排N1到N5和第二排的前6個(gè)位點(diǎn)(D516V到S531W)是利福平耐藥相關(guān)基因rpoB檢測(cè)探針；其他的第315和-15位點(diǎn)分別是異煙肼的耐藥相關(guān)基因katG和inhA檢測(cè)探針。第三排43N、88N代表鏈霉素rpsL基因第43和88位密碼子位點(diǎn)為野生型，43M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生突變。第三排306N代表乙胺丁醇embB基因第306位點(diǎn)為野生型，306M1 306M2、306M3代表乙胺丁醇embB基因位點(diǎn)發(fā)生不同類型的突變。(2)516代表相關(guān)基因(這里是rpoB)上第516個(gè)氨基酸，其他位點(diǎn)類同；在rpoB基因相關(guān)位點(diǎn)中，N1探針覆蓋的位點(diǎn)有511和513及附近區(qū)域位點(diǎn)，即若正常位點(diǎn)中只有N1位點(diǎn)不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點(diǎn)發(fā)生了突變，其他位點(diǎn)類同；以下是幾個(gè)正常探針覆蓋到的位點(diǎn)及附近區(qū)域(N1:511、513；N2:516；N3:522、523；N4:526、529；N5:531、533)；突變位點(diǎn)的氨基酸變化：D516V：D→V，代表天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸；其他氨基酸含義：H為組氨酸，Y為酪氨酸，L為亮氨酸，S為絲氨酸，T為蘇氨酸，N為天冬氨酸。(3)編號(hào)5膜條代表RHSE均“S”，編號(hào)6膜條代表RHSE分別為“R、S、S、S”，編號(hào)38膜條代表RHSE分別為“S、R、S、S”，編號(hào)4膜條代表RHSE分別為“R、R、S、S”，編號(hào)51膜條代表RHSE分別為“R、R、R、S”，編號(hào)3膜條代表RHSE分別為“R、R、R、R”；“R”代表耐藥，“S”代表敏感

圖1 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的膜條顯色示例圖

25株耐藥基因突變的菌株中，rpoB基因突變占68.0%(17/25)，katG+inhA基因突變占80.0%(20/25)，rpsL基因突變占52.0%(13/25)，embB基因突變占12.0%(3/25)。不同突變類型各個(gè)突變基因位點(diǎn)的檢出情況見表2。

表2 不同突變基因在25株耐藥菌株中的檢出情況

三、反向斑點(diǎn)雜交法與藥敏試驗(yàn)比較

以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，用反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)44株痰培養(yǎng)陽(yáng)性Mtb菌株對(duì)抗結(jié)核藥物RFP、INH、Sm、EMB耐藥基因突變的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，具體見表3。

討 論

2011—2015年全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃要求，以地市級(jí)為單位開展耐多藥肺結(jié)核診治工作的覆蓋率要達(dá)到50%，耐多藥肺結(jié)核可疑者篩查率達(dá)到60%[5]。因此，快速準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床用藥以提高結(jié)核病治療療效，防止耐藥Mtb的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。Mtb耐藥基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)是將高敏感度的PCR技術(shù)和高通量的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)。其原理是應(yīng)用生物素修飾的特異性引物擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因，將帶有生物素標(biāo)記物的PCR產(chǎn)物變性后與標(biāo)記在硝酸纖維素膜上的特異性探針雜交，經(jīng)生物素或過氧化物酶系統(tǒng)顯色，通過膜條上探針雜交后是否顯色，來判斷是否發(fā)生耐藥基因突變。若突變位點(diǎn)顯色即發(fā)生耐藥基因突變，若野生位點(diǎn)顯色即未發(fā)生耐藥基因突變。

Mtb對(duì)利福平耐藥主要是由于rpoB基因編碼區(qū)發(fā)生了點(diǎn)突變、微缺失或微插入等。編碼的RNA 聚合酶β亞基構(gòu)象發(fā)生變化，利福平與其親合力降低所致[6-7]。而rpoB基因是編碼β亞基的編碼基因，95%以上的耐利福平藥物耐藥菌都發(fā)生rpoB基因突變[8]，突變主要集中在第507～533氨基酸位點(diǎn)范圍內(nèi)，其中80%突變與第531、526位點(diǎn)高度相關(guān)。異煙肼耐藥則與KatG基因突變及inhA基因突變密切相關(guān)[9-10]，這些突變基因都直接或間接地參與異煙肼中間活性體的形成。最常見的katG基因突變位點(diǎn)為第315位點(diǎn)，它的發(fā)生頻率約為76.7%。inhA的耐異煙肼突變主要發(fā)生在其啟動(dòng)子區(qū)的-15位點(diǎn)上[11]。 耐鏈霉素與核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)及16S rRNA編碼蛋白(rrs)突變相關(guān)[12]，而大約有69%的乙胺丁醇耐藥菌株都檢測(cè)出embB的突變[13]，第306位密碼子突變?cè)谀退幘曛凶顬槌Ｒ?，還有第303、330位密碼子的突變都能導(dǎo)致Mtb對(duì)乙胺丁醇耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)與反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析

注 敏感度=藥敏試驗(yàn)、反向斑點(diǎn)雜交法均陽(yáng)性株數(shù)/藥敏試驗(yàn)陽(yáng)性株數(shù)×100%；特異度=藥敏試驗(yàn)、反向斑點(diǎn)雜交法均陰性株數(shù)/藥敏試驗(yàn)陰性株數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=藥敏試驗(yàn)、反向斑點(diǎn)雜交法均陽(yáng)性株數(shù)/反向斑點(diǎn)雜交法陽(yáng)性株數(shù)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=藥敏試驗(yàn)、反向斑點(diǎn)雜交法均陰性株數(shù)/反向斑點(diǎn)雜交法陰性株數(shù)×100%

本研究采用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)浙江溫州地區(qū)93份痰標(biāo)本進(jìn)行rpoB、katG、inhA、rpsL、embB基因突變檢測(cè)，同時(shí)采用液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，分析該技術(shù)檢測(cè)RFP、INH、Sm、EMB耐藥性的敏感度、特異度等指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，38.6%的Mtb菌株為耐藥菌株，其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的88.2%，說明溫州地區(qū)耐藥結(jié)核病的流行趨勢(shì)嚴(yán)重。

反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)Mtb陽(yáng)性菌株57株，檢出率為61.3%，與單萬水等[14]報(bào)道相似。本研究中，反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)INH、RFP、Sm、EMB的耐藥基因的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道相似[15-16]。其中，44株臨床菌種與藥敏試驗(yàn)相比，存在假陽(yáng)性耐藥基因突變株，出現(xiàn)與液體藥敏結(jié)果不同的假陽(yáng)性結(jié)果，可能與擴(kuò)增標(biāo)本中DNA是既往殺滅的Mtb的DNA，也可能是每一種藥物的耐藥基因突變是逐漸積累的結(jié)果，很少量的耐藥菌株能擴(kuò)增為陽(yáng)性，但藥敏試驗(yàn)并不一定表現(xiàn)為耐藥，包括藥敏試驗(yàn)過程中一些人為因素也可能導(dǎo)致結(jié)果的不一致。此外，仍存在未檢測(cè)出突變位點(diǎn)的耐藥菌株，尤其是檢測(cè)EMB、Sm耐藥株敏感度較低，可能由于探針數(shù)量的限制，突變類型在本檢測(cè)芯片設(shè)計(jì)的探針之外或者存在其他的耐藥機(jī)制。

目前，臨床Mtb耐藥性的檢測(cè)以液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)為主，此法不僅操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，一般需要4～6周，且培養(yǎng)困難，難以滿足臨床需要。GeneXpert Mtb/RIF系統(tǒng)雖然檢測(cè)Mtb的敏感度和特異度高，但僅能檢測(cè)利福平rpoB基因是否發(fā)生耐藥[17]。而利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)Mtb耐藥法不僅能同時(shí)檢測(cè)異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇是否發(fā)生耐藥，還能檢測(cè)出基因發(fā)生耐藥突變的具體位點(diǎn)或區(qū)域，檢測(cè)時(shí)間僅需1 d，可應(yīng)用于臨床Mtb耐藥性的篩查，指導(dǎo)抗結(jié)核藥物的臨床選用，從而減少耐藥Mtb的傳播，降低耐藥率和死亡率。

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(本文編輯：王然 李敬文)

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.016

325000 浙江省溫州市中心醫(yī)院感染科(施伎蟬、蔣賢高、寧洪葉、何貴清、吳正興、蔡玉偉、程愛瓊)；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室(余志杰)

蔣賢高，Email：jiangxiangao368@163.com

2015-08-11)