邢歡，許文宗，李婕，徐仰倉，2，*（.天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457；2.天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457）

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綠色木霉自絮凝固定化條件研究

邢歡1，許文宗1，李婕1，徐仰倉1，2，*
（1.天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457；2.天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457）

摘要：探究綠色木霉自絮凝固定化條件，以便提高其分泌纖維素酶的能力。首先測定固定化時間、體積、pH、葡萄糖與蛋白胨濃度對自絮凝固定化綠色木霉分泌纖維素酶的影響，然后用正交試驗設計進行優(yōu)化組合。時間、體積和pH對自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶的影響均呈鐘形曲線；葡萄糖對自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶影響不大；蛋白胨對自絮凝綠色木霉分泌纖維素酶影響較大。綠色木霉自絮凝固定化最優(yōu)條件是：時間為6 d，pH為6，體積為70 mL，葡萄糖為2.25%，蛋白胨為1.50%。按此條件培養(yǎng)自絮凝固定化的綠色木霉72h，分泌的纖維素酶活性為3.55 U。

關鍵詞：自絮凝；正交試驗；綠色木霉；纖維素酶

*通信作者

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，占陸地生態(tài)系統(tǒng)生物量的80 %，每年通過全球生物合成可再生性纖維素達1 000億t以上[1]。綠色木霉是產(chǎn)纖維素酶的高產(chǎn)菌株之一[2]，綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶對纖維素有降解作用，纖維素可以被降解為人類可直接利用的葡萄糖，以解決世界糧食問題；也可降解為乙醇，以解決世界能源問題；還可破壞植物細胞壁，以提高天然活性產(chǎn)物的提取率等。由于固定化細胞具有生長快、反應快、抗污染能力強、可連續(xù)使用、提高產(chǎn)品的轉化率和生產(chǎn)效率，便于產(chǎn)物分離等特點，正越來越廣泛地應用于食品與發(fā)酵工業(yè)中[3]，綠色木霉固定化技術的應用已經(jīng)成為現(xiàn)在食品工業(yè)微生物研究的主要趨勢之一[4]。優(yōu)化與改進綠色木霉的固定化條件對于提高產(chǎn)纖維素酶活和延長產(chǎn)酶半衰期尤為重要[5]，而應用正交試驗設計優(yōu)化綠色木霉自絮凝固定化條件的研究還鮮見報道。為此，我們采用正交試驗設計，以纖維素酶活為指標，對影響綠色木霉固定化的一些關鍵因素進行了研究與分析。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

綠色木霉（Trichoderma viride AS3.3711）購自中科院微生物研究所。

1.1.2儀器

752N 752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀有限公司；2PG-280智能光照培養(yǎng)箱：黑龍江東拓儀器制造公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1綠色木霉自絮凝固定化

采用PDA固體培養(yǎng)基[6]培養(yǎng)綠色木霉，待表面長出綠色孢子后將其接入到PDA液體培養(yǎng)基中。PDA液體培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，馬鈴薯濃度為20 %，溫度為28℃，pH為自然，體積為70 mL，靜態(tài)光照固定培養(yǎng)時間為5 d。

1.2.2纖維素酶活力測定

參照趙凱[7]的方法，略加改動，反應體系包括：0.5 mL酶液、1.5 mL檸檬酸緩沖液、3 mL DNS試劑，540 nm處測吸光度。根據(jù)還原糖的生成量計算酶活性，酶活力單位定義：發(fā)酵液在（50±0.1）℃，pH 4.8條件下，1 h水解濾紙底物，產(chǎn)生出相當于1 μmol葡萄糖的還原糖量，為1個酶活力單位，以U表示。

1.2.3單因素對綠色木霉自絮凝效果的影響

1.2.3.1固定時間對綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，pH為自然，培養(yǎng)體積為70 mL，固定化時間：5、6、7、8、9、10 d。研究時間對綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.2固定pH對綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，培養(yǎng)體積為70 mL，固定化時間為6 d，pH：5、5.5、6、6.5、7、7.5。研究pH對綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.3固定體積對綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.00 %，蛋白胨濃度為2.00 %，固定化時間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積：30、40、50、60、70、80 mL。研究體積對綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.4葡萄糖對綠色木霉自絮凝的影響

蛋白胨濃度為2.00 %，固定化時間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積為70 mL，葡萄糖濃度：1.25 %、1.50 %、1.75 %、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究葡萄糖對綠色木霉固定化的影響。

1.2.3.5蛋白胨對綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖濃度為2.25 %，固定化時間為6 d，pH為6，培養(yǎng)體積為70mL，蛋白胨濃度：1.25%、1.50%、1.75%、2.00 %、2.25 %、2.50 %。研究蛋白胨對綠色木霉固定化的影響。

1.2.4正交試驗設計

根據(jù)正交試驗設計原理[8-9]，綜合單因素試驗結果，選取葡萄糖，蛋白胨，pH，體積，時間為試驗因素。對各因素安排5個等間距濃度梯度，設誤差列，按L25（56）正交設計表安排試驗。測定纖維素酶活力，確定最優(yōu)固定化條件。采用Excel和Latin軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與分析。

2　結果與分析

2.1綠色木霉自絮凝固定化

綠色木霉在PDA液體表面按照三角錐形瓶的形狀自絮凝形成圓形膠塊。經(jīng)測定自絮凝塊的平均直徑為5.4 cm，質量為0.42 g，培養(yǎng)液中纖維素酶的活性為2.55 U，綠色木霉自絮凝形態(tài)見圖1。

圖1　自絮凝固定化的綠色木霉Fig.1 Self-flocculating T.viride

2.2單因素對綠色木霉自絮凝效果的影響

2.2.1固定時間對綠色木霉自絮凝的影響

將50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基倒入自絮凝的綠色木霉中，在28℃，110r/min下培養(yǎng)72 h。之后，利用濾紙酶活法測纖維素酶活性。固定時間對綠色木霉自絮凝的影響見圖2。

圖2　固定時間對酶活力的影響Fig.2 The effect of immobilization times on cellulase activity

由圖2可知，隨著時間的增長，纖維素酶活增高。在6 d時達到最大，但時間進一步增加時，纖維素酶活下降，可能是綠色木霉膠塊表面菌絲退化所致。

2.2.2固定pH對綠色木霉自絮凝的影響

固定pH對綠色木霉自絮凝的影響見圖3。

圖3　固定pH對酶活力的影響Fig.3 The effect of pH on cellulase activity

由圖3可知，隨著pH增大，纖維素酶活增高，在6時達到最大。這是由于綠色木霉喜歡在偏酸性環(huán)境下生長。但pH繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降，試驗發(fā)現(xiàn)pH偏高不利于綠色木霉進行自絮凝，所成膠塊松散不完整。

2.2.3固定體積對綠色木霉自絮凝的影響

固定體積對綠色木霉自絮凝的影響見圖4。

圖4　固定體積對酶活力的影響Fig.4 The effect of immobilization volume on cellulase activity

由圖4可知，隨著體積增大，纖維素酶活先下降，到達50mL時最低，之后酶活性與體積成正比，在70mL時，酶活達到最高。但體積繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降。體積主要是影響營養(yǎng)物質的供給量，較少的營養(yǎng)供給使綠色木霉自絮凝形成的膠塊較薄甚至使綠色木霉不能自絮凝成膠塊，所以酶活較低。在較高體積時，膠塊偏小導致酶活降低。

2.2.4葡萄糖對綠色木霉自絮凝的影響

葡萄糖對綠色木霉自絮凝的影響見圖5。

由圖5可知，隨著葡萄糖的增加，纖維素酶活增高，在2.25 %時為最大。葡萄糖提供碳源，實驗中供給的碳源越多，綠色木霉自絮凝成膠情況就越好，自絮凝膠塊在發(fā)酵時所分泌的纖維素酶酶活就越高。

2.2.5蛋白胨對綠色木霉自絮凝的影響

蛋白胨對綠色木霉自絮凝的影響見圖6。

圖5　葡萄糖對酶活力的影響Fig.5 The effect of glucose on cellulase activity

圖6　蛋白胨對酶活力的影響Fig.6 The effect of peptone on cellulase activity

由圖6可知，隨著蛋白胨增加，纖維素酶活增高，在1.50 %時達到最大。但pH繼續(xù)增大，則纖維素酶活下降。觀察發(fā)現(xiàn)蛋白胨濃度較低時，綠色木霉自絮凝成膠較好。蛋白胨濃度越高時，綠色木霉越難自絮凝且膠塊成松散狀態(tài)。

2.3綠色木霉自絮凝固定化產(chǎn)酶特性正交試驗結果

為了確定5種因素的影響纖維素酶活順序以及最優(yōu)試驗組合，根據(jù)單因素試驗結果，按L25（56）正交設計表安排試驗結果見表1，綠色木霉自絮凝固定化正交試驗結果見表2。

表1　正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2　正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

續(xù)表2正交試驗結果Continue table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，5種因素中，對自絮凝綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活性影響從大到小重要性排序依次為：蛋白胨濃度＞培養(yǎng)體積＞時間＞pH＞葡萄糖濃度。蛋白胨濃度對綠色木霉自絮凝形成膠塊的影響較大，葡萄糖濃度的影響最低。根據(jù)正交試驗結果確定最佳的固定化條件為：時間為6 d，pH為6.5，培養(yǎng)體積為70 mL，葡萄糖濃度為2.25 %，蛋白胨濃度為1.50 %。對比單因素試驗，除了pH得到的最優(yōu)條件不同，其它條件都相同。按照以上最優(yōu)試驗A1B3C4D4E1結果設計試驗，進行3次自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)纖維素酶活力測定，所得樣品的酶活力均值為3.55 U，綠色木霉自絮凝固定化正交試驗方差分析結果見表3。

表3　方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

由表3可知，當顯著水平a=10%時，F(xiàn)D＞4.110，所以蛋白胨對自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)酶具有顯著性影響，而其它因素的F值均小于4.110，所以沒有顯著性影響。

3　討論與結論

經(jīng)過單因素與正交試驗方法得到自絮凝固定化綠色木霉的最優(yōu)條件為：時間為6 d，pH為6.5，體積為70 mL，葡萄糖為2.25 %，蛋白胨為1.50 %。這些條件主要通過影響自絮凝膠塊的大小及薄厚來影響纖維素酶活性。相比于沒有優(yōu)化之前，纖維素酶活性提高到原來的1.4倍。試驗表明固定時間越長，PDA溶液中的綠色木霉由于缺少氧氣停止生長，菌絲附著停止甚至退化死亡。pH偏高或偏低都不利于綠色木霉進行自絮凝，所成膠塊松散不完整，因為綠色木霉在發(fā)生網(wǎng)結現(xiàn)象時[4]，自身會分泌物質增強綠色木霉粘連，pH過低或過高可能會對這種物質的合成產(chǎn)生抑制作用。因為綠色木霉是在PDA液體表面進行自絮凝的，越往上，三角瓶直徑越小，所以酶活越低。葡萄糖作為碳源是微生物可以直接利用的營養(yǎng)物質，葡萄糖對綠色木霉自絮凝有一定的影響但影響不大。通過方差分析，當顯著水平a=10%時，蛋白胨對自絮凝固定化綠色木霉產(chǎn)酶具有顯著性影響。蛋白胨主要提供氨基酸。真菌能夠分解自然界中的蛋白質變成可被吸收的氨基酸，真菌利用蛋白質能力是依賴其分泌蛋白酶分解大分子為較小基質的能力。因為綠色木霉菌絲之間需要聚集成膠從而才能分泌大量降解蛋白質的酶，所以少量的蛋白胨對綠色木霉自絮凝具有促進作用。但當?shù)鞍纂诉^多時，具有底物反饋抑制作用，在一定程度上抑制了綠色木霉自絮凝。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉能進行自絮凝固定化，且經(jīng)過發(fā)酵后，酶活性到達較高的水平，用自絮凝法固定化綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶具有潛在的應用價值。

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Study on the Conditions of Trichoderma Viride Immobilized with Self-flocculation

XING Huan1，XU Wen-zong1，LI Jie1，XU Yang-cang1，2，*
（1.College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin 300457，China）

Abstract：Researching on the conditions of Trichoderma viride immobilized with self-flocculation，so we could get high cellulase activity.First，we measured the effects of time，volume，pH，glucose and peptone concentrations on cellulase activity of self-flocculating immobilized Trichoderma viride.Then we used the orthogonal test design to obtain optimized combinations.The times，volumes and pH had a bell shaped curve effect on cellulase activity of immobilized Trichoderma viride with self-flocculating.The glucoses had small effect on cellulase ac

tivity，but the peptone had great effect on cellulase activity.The best optimal conditions of self-flocculation of immobilized Trichoderma viride were 6 d of time，70 mL of volume，6 of pH，2.25 % of glucoses and 1.50 % of peptones.Under the optimized conditions，the cellulase activity could reach 3.55 U after Trichoderma viride for cultivating of 72 h.

Key words：self-flocculating；orthogonal test；Trichoderma viride；cellulase

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.031

基金項目：教育部留學回國人員科研啟動基金（第44批）；天津市科技興海項目（KJXH2012-14）

作者簡介：邢歡（1989—），男（漢），研究生，研究方向：生物工程。

收稿日期：2014-11-27