徐婕，湯韌，吉樹臣，姜淑妍，徐楠楠（長春市農(nóng)業(yè)學校，吉林長春130022）

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酶法輔助提取茶多酚的工藝研究

徐婕，湯韌，吉樹臣，姜淑妍，徐楠楠
（長春市農(nóng)業(yè)學校，吉林長春130022）

摘要：以湖北通城縣茶葉產(chǎn)區(qū)的綠茶為原料，研究纖維素酶和果膠酶復合輔助提取茶多酚的最佳工藝參數(shù)。通過單因素試驗和正交試驗分析酶用量、浸提時間、浸提溫度和pH對茶多酚提取率的影響，進而對茶多酚提取的工藝條件進行優(yōu)化設計。結果表明：pH和纖維素酶用量對茶多酚提取率影響顯著，優(yōu)化后的提取工藝條件為纖維素酶用量200U/mL、果膠酶用量300U/mL、浸提時間50min、浸提溫度為40℃、pH5.0，此最佳條件下的茶多酚提取率為23.54%，DPPH自由基清除率達30%，顯示出優(yōu)異的抗氧化性能。

關鍵詞：茶多酚；酶輔助；工藝參數(shù)；提取率；活性

茶多酚（tea-polyphenols，簡寫TP）是一類由黃烷醇類物質(zhì)、花色素、酚酸及其縮酚酸等組成的復合物，約占茶葉干重的15 %～30 %[1]，主要存在于茶葉細胞液泡中。茶多酚在常溫下為淺黃色無定形粉末，有較強的極性和一定的親水性。溶液顯弱酸性，對熱和酸較穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中易氧化褐變。茶多酚是茶葉中主要的藥理成分，是一種理想的天然食品抗氧化劑，其抗氧活性高于一般非酚性或單酚羥基類抗氧劑。大量研究表明，茶多酚具有高效消除體內(nèi)自由基、抗衰老、防癌抗癌、預防心血管疾病、抗菌消炎、防輻射、除臭等多種生物功能，在食品、醫(yī)藥等各領域都有廣闊的應用前景和開發(fā)價值[2]。

目前，茶多酚的提取工藝主要分為有機溶劑萃取法、金屬離子沉淀法、膜分離法、超臨界CO2萃取法、樹脂吸附分離法。但上述方法都存在著不足：有機溶劑萃取法提取茶多酚的工序繁瑣，蒸餾濃縮時間較長，茶多酚用熱水浸提后更容易被氧化，使其生物活性降低；金屬離子沉淀法中使用的偏堿性金屬離子和調(diào)節(jié)酸堿度的操作都會降低部分酚類物質(zhì)的活性[3]；膜分離法以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，不采用有機溶劑和加熱處理，故得到的茶多酚活性較高，但成本太高，難以普及[4]；超臨界CO2萃取法操作溫度低，保證了被提取物不被破壞，產(chǎn)品純度較高，但因茶多酚提取率過低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[5]。近年來，國外研究者將酶法引入植物組分中有效成分的提取。果膠酶和鞣酸酶配合使用提取蘋果皮中的酚類物質(zhì)[6]、用果膠酶提取橄欖中的橄欖油[7]及對紅茶提取物進行酶處理[8]等研究結果表明，酶法可在不同程度上提高有效成分的提取率，證明了酶法輔助提取的可行性。

本試驗采用酶法輔助提取茶葉中茶多酚，通過正交設計優(yōu)化茶多酚提取的工藝參數(shù)，為酶法輔助提取茶多酚的試驗研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

綠茶葉采自湖北通城縣茶葉產(chǎn)區(qū)，經(jīng)通風干燥后采用植物粉碎機粉碎，并用100目標準篩篩分，篩分后的茶粉保存于棕色干燥瓶中，作為提取茶多酚的原料。

1.2儀器

FW177型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；PH070A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；PB-10標準型電化學分析儀：德國Sartorius集團；TU-1810型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3試劑

纖維素酶、果膠酶：活力均大于15 000 U/g，產(chǎn)自西隴化工股份有限公司；雙重蒸餾水、甲醇水溶液（體積比7：3）、10 mmol/L的HCl；碳酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、福林酚試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）標準品、鄰苯三酚、三羥甲基-氨基甲烷（TRIS)：均為分析純。以上試劑均采購自長春市宏宇化工有限公司，生產(chǎn)廠家為北京北化精細化學品有限責任公司、國藥集團試劑有限公司。

1.4方法

1.4.1茶多酚的提取

分別采用纖維素酶、果膠酶單獨作用和二者復合作用的方法提取茶多酚。首先，對各種反應條件進行優(yōu)化，然后分別在最佳條件下進行提取，提取過程完成后，將提取物真空抽濾，得茶多酚浸提液，取樣測定茶多酚含量。

1.4.2茶多酚提取率的測定

TP的測定按GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行[9]。其原理是福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團并顯藍色。

用移液管分別移取沒食子酸工作液、雙重蒸餾水（作空白對照）及測試液各1.0 mL于刻度試管內(nèi)，在每個試管內(nèi)分別加入5.0 mL的福林酚試劑，搖勻。反應3min～8min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5 % Na2CO3溶液，加雙重蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫下放置60min。用10 mm比色杯，以試劑空白溶液做參比，用紫外-可見分光光度計在波長765 nm處測定吸光度，茶多酚的提取率按式（1）計算。

式中：A為樣品測試液吸光度；V為樣品提取液體積，10 mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成100 mL，其稀釋因子為100）；SLOPEStd為沒食子酸標準曲線的斜率；m為樣品干物質(zhì)含量，%；m1為樣品質(zhì)量，g。

1.4.3抗氧化性能評價

將1.4.1中得到的茶多酚浸提液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上65℃進行真空濃縮，濃縮的樣品置于電熱鼓風干燥箱50℃烘干至恒重，得到茶多酚粗品，通過測定其對DPPH自由基的清除率，評價其抗氧化性能。

配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL茶多酚待測液。稱取10.3 mg DPPH自由基，用無水乙醇定容至250 mL，溶液濃度為0.1 mmoL/L，將其盛于棕色容量瓶中，置于暗處保存。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL待測液，加入2 mL DPPH溶液，用無水乙醇將體系均補至4 mL，搖勻，室溫放置30min后，以無水乙醇作為參比，測定各體系在517 nm波長處的吸光度Ai；將樣品用等體積水代替，即體系中僅含DPPH和無水乙醇，其他同前，測定吸光度Ac。另將DPPH溶液用等體積水代替，即體系中僅含樣品和無水乙醇，其他同前，測定吸光度Aj。DPPH自由基的清除率可利用下式（2）進行計算。

式中，K為清除率；Ai為加試樣反應后DPPH溶液的吸光度；Aj為不加DPPH，只加試樣溶液的吸光度；Ac為不加試樣，只加DPPH溶液的吸光度。

2　結果與分析

2.1影響茶多酚提取的單因素試驗

2.1.1酶用量對茶多酚提取率的影響

茶多酚提取實質(zhì)上是茶多酚從茶葉細胞內(nèi)擴散到溶劑中的非穩(wěn)態(tài)非平衡傳質(zhì)過程。整個過程大致分為3個階段：溶劑向茶葉內(nèi)部的滲透和浸潤；茶葉內(nèi)部溶質(zhì)的溶解；溶質(zhì)從茶葉內(nèi)部向周圍溶液的擴散。而酶的作用在于使茶葉細胞壁軟化、膨脹和崩潰，即破壁，因此，酶用量是酶法輔助提取茶多酚首要考慮的參數(shù)。

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，分別加入纖維素酶和果膠酶0、100、200、300、400U/mL，在40℃恒溫水浴鍋中浸提50min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測得提取出的茶多酚的含量，比較不同酶用量對茶多酚提取率的影響，得到最佳酶用量，試驗結果見圖1和圖2。

圖1　纖維素酶用量對茶多酚提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase dosage on TP extraction efficiency

圖2　果膠酶用量對茶多酚提取率的影響Fig.2 Effect of pectinase dosage on TP extraction efficiency

從圖1和圖2可以看出，在試驗條件下，纖維素酶和果膠酶的最佳用量分別在200U/mL和300U/mL。隨著纖維素酶和果膠酶用量的增加，茶多酚提取率迅速增大，分別在200U/mL和300U/mL時達到最大值，繼續(xù)增加纖維素酶和果膠酶的用量，茶多酚的提取率增長緩慢并趨向穩(wěn)定。這是因為，一方面，作為固體底物的茶粉在溶液中不能充分擴散，在較低的酶濃度下，酶尚可與底物較充分地結合，隨著酶濃度的升高，底物濃度對酶達到飽和，由于酶與底物的接觸面積受限，酶的作用受到抑制，進而影響了茶多酚的提取率。另一方面，雖然適量的酶可以通過破壁改變細胞壁的通透性，使得細胞壁破裂增加有效成分的溶出，提高茶多酚的提取率，但是茶多酚的分子可以與蛋白質(zhì)和氨基酸發(fā)生很強的絡合反應[10]，而酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，當酶過量時就會與茶多酚絡合，最終影響茶多酚的提取率。因此，酶用量并非越大越好。

2.1.2浸提時間對茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，在40℃恒溫水浴鍋中分別浸提35、50、65、80、95min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測定茶多酚提取量，比較不同浸提時間對茶多酚提取率的影響，得到最佳浸提時間，結果見圖3。

圖3　浸提時間對茶多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on TP extraction efficiency

從圖3可以看出，在試驗條件下，最佳浸提時間為80min。隨著浸提時間的增加，茶多酚提取率逐漸增大，在80min時達到最大值，之后茶多酚的提取率基本維持穩(wěn)定。這是因為于隨著酶解浸提時間的延長，茶葉細胞壁及細胞間層的纖維素和果膠質(zhì)形成的阻擋層已被有效破解，茶多酚大多已從細胞內(nèi)擴散到溶液中，細胞內(nèi)外的茶多酚濃度已達到了一種動態(tài)平衡，繼續(xù)延長提取時間對提高溶液中茶多酚濃度作用有限。

2.1.3浸提溫度對茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，分別在30，40、50、60、70℃下浸泡50min，在轉(zhuǎn)速3500r/min的離心機中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測得提取出的茶多酚的含量，比較不同浸提溫度對茶多酚提取率的影響，得到最佳浸提溫度，結果見圖4。

從圖4可以看出，在試驗條件下，最佳浸提溫度在40℃。隨著浸提溫度的增加，茶多酚提取率逐漸增大，在40℃時達到最大值，隨著浸提溫度的繼續(xù)增加，茶多酚的提取率反而下降。這是因為茶多酚提取需要適宜的酶解溫度，在達到最適溫度前，隨著溫度增加，酶活力逐漸增強，一旦超過最適溫度，酶活力開始下降，繼續(xù)增加溫度，會使酶結構遭到破壞，進而導致酶變性失活，徹底失去催化活性。

圖4　浸提溫度對茶多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on TP extraction efficiency

2.1.4pH對茶多酚提取率的影響

精確稱取1.000 0 g茶粉共5份，以蒸餾水為溶劑，按液固比為20∶1（mL/g）加入錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)pH至4.6、4.8、5.0、5.2、5.4，在40℃恒溫水浴鍋中浸提50min，在轉(zhuǎn)速3 500r/min的離心機中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測得提取出的茶多酚的含量，比較不同pH對茶多酚提取率的影響，得到最佳pH，結果見圖5。

圖5　pH對茶多酚提取率的影響Fig.5 Effect of pH on TP extraction efficiency

從圖5可以看出，在試驗條件下，最佳pH為4.8。隨著pH逐漸增加到4.8，茶多酚提取率逐漸增大至最大值，繼續(xù)增大pH，茶多酚的提取率開始下降。這是因為與浸提溫度對酶活性的影響類似，酶的活性也受溶液pH影響。在最適pH時，酶具有最大的催化活力；當偏離最適pH時，酶的活性中心或與之有關的基團發(fā)生變化，進而影響酶的活力；在嚴重偏離最適pH時，酶蛋白可能會因自身結構變性而失去活力。

2.2正交試驗優(yōu)化茶多酚提取工藝

2.2.1正交試驗設計

按照上述提取工藝，在多次單因素試驗基礎上，選擇酶用量、浸提時間、浸提溫度、pH為研究對象，按照L16（45）進行五因素四水平的正交試驗，對茶多酚提取的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。試驗結果如表1所示。

表1　正交試驗結果Table 1 Result of orthogonal experiment

2.2.2極差分析

在正交試驗中，以茶多酚的提取率為考察指標，對試驗結果進行極差分析，分析結果見表2。通過極差分析得到，pH對茶多酚的提取率影響最大，纖維素酶用量次之，果膠酶用量再次之，然后是浸提時間，浸提溫度對茶多酚的提取率影響最小，最優(yōu)組合為A3B4C2D2E3，即纖維素酶用量為200U/mL、果膠酶用量300U/mL、浸提時間50min、浸提溫度為40℃、pH 5.0。

表2　極差分析表Table 2 Range analysis table

2.2.3方差分析

為證實試驗數(shù)據(jù)可行有效，對試驗結果進行方差分析，分析結果見表3。

由方差分析表可知，在試驗條件下，pH和果膠酶用量是影響茶多酚提取率的顯著性因素。根據(jù)此優(yōu)化的條件，精確稱取1.000 0 g茶粉，以蒸餾水為溶劑，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)提取體系的pH為5.0，按液固比為20：1（mL/g）加入錐形瓶中，加入酶活力分別為200U/mL和300U/mL的纖維素酶和果膠酶，在溫度為40℃的恒溫水浴鍋中反應50min，然后在轉(zhuǎn)速為3 500r/min的離心機中離心10min，取上清液，同1.4.2的操作，測得提取出的茶多酚的提取率。通過3次重復試驗，得到茶多酚的提取率為23.54 %，由此，驗證了正交試驗所得結果的可靠性。

表3　方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.3茶多酚活性測定試驗

兒茶素是茶多酚的主要成分，其結構中的酚性羥基有較強的供氫能力，極易捕獲過氧基團，表現(xiàn)出極強的自由基清除能力[11]。DPPH·是一種穩(wěn)定的有機自由基，通過檢測茶多酚對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強弱。按照1.4.2操作，用提取后茶多酚對DPPH自由基清除率來表征茶多酚活性的高低，試驗結果見表4顯示。

表4　茶多酚對DDPH自由基清除率Table 4 TPs on DPPH radical scavenging rate

茶多酚對DPPH自由基清除作用隨時間的變化情況見圖6。

圖6　茶多酚對DPPH自由基清除率隨時間的變化Fig.6 TPs on DPPH radical scavenging rate changes over time

由圖6可以看出，在試驗條件范圍內(nèi)，隨著處理時間的延長，提取液對DPPH自由基的清除率呈明顯上升趨勢，浸提的新鮮樣液在45min后，抗自由基活性趨于穩(wěn)定，DPPH自由基清除率可達30 %，顯示了茶多酚較高的抗氧化和清除自由基能力。

3　討論

1）纖維素酶和果膠酶復合輔助提取茶多酚的最佳工藝條件：對于1.0000g茶粉，纖維素酶活力200U/mL，果膠酶活力300U/mL，浸提時間50min，浸提溫度40℃，pH 5.0。

2）正交試驗結果的極差分析表明，5個因素對茶多酚提取率的影響順序為：pH＞纖維素酶用量＞果膠酶用量＞浸提時間＞浸提溫度。方差分析結果表明，5個因素中pH和果膠酶用量為影響茶多酚提取率的顯著性因素。

3）在試驗條件下，采用纖維素酶和果膠酶復合輔助提取茶多酚的最大提取率可達22.84 %，高于傳統(tǒng)溫水浸提取至少10個百分點，并且茶多酚活性測定的試驗結果顯示，茶多酚在提取后的1 h內(nèi)DPPH自由基清除率高達30 %，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性能。

4）此外，酶法可在常壓、較低溫度條件下破碎茶葉細胞細胞壁，反應溫和，易操控，因此在解決茶葉原料粉碎、縮短提取時間、降低能耗等方面也具有一定優(yōu)勢。

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Research of the Extraction Processing of Tea Polyphenols

XU Jie，TANG Ren，JI Shu-chen，JIANG Shu-yan，XU Nan-nan
（Changchun Agricultural School，Changchun 130022，Jilin，China）

Abstract：The green tea，obtained from tea-producing areas of the Tongcheng County of Hubei Province，was chosen as raw material.The optimum conditions were carefully studied in the process of assisted extraction of tea polyphenols from mixture of cellulose and pectinase.The impact of enzyme concentration，extraction time，extraction temperature and pH on tea polyphenols extraction rate was analyzed by single factor and orthogonal experiments，which was used to optimize the design of tea polyphenols extraction process conditions.The results showed that pH and cellulose significant could huge impact on the extraction of tea polyphenols.The optimal extraction conditions were cellulose 200U/mL，the pectinase 300U/mL，extraction time 50min，extraction temperature 40℃，pH 5.0.The polyphenols extracted under optimum conditions was 23.54 % and the DPPH free radical clearance rate was 30 %，which showed excellent antioxidant properties.

Key words：tea polyphenols；enzyme-assisted；process parameters；extraction rate；activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.021

作者簡介：徐婕（1987—），女（滿），助理講師，在讀碩士，主要從事食品衛(wèi)生及安全方面的研究。

收稿日期:2014-12-10