林海楨，施勝英，李舒婕，周溦，林敬明（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510282）

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內(nèi)蒙紫草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

林海楨，施勝英，李舒婕，周溦，林敬明*
（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510282）

摘要：以內(nèi)蒙紫草總黃酮得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取工藝，并以蘆丁為對(duì)照，測(cè)定內(nèi)蒙紫草總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的內(nèi)蒙紫草總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.57%，料液比1∶43.33（g/mL），超聲時(shí)間3.33h，此時(shí)總黃酮得率4.94%。

關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙紫草；總黃酮；超聲波輔助提取；響應(yīng)面法；抗氧化活性

內(nèi)蒙紫草，又名黃花軟紫草、黃紫草、假紫草[1]，紫草科軟紫草屬植物，分布于甘肅，內(nèi)蒙古等地[2]，藥用干燥根，主要成分有蒽醌、多糖、黃酮等化合物，具有較好的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、保肝降酶等作用[3]，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。超聲波能在液體中產(chǎn)生“空穴作用”，破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使提取液不斷振蕩，有助于黃酮類化合物的溶出和擴(kuò)散，同時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)保持一定水溫，大大提高了植物中有效成分的得率[4]。響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將多因子試驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系[5]。因此，本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取內(nèi)蒙紫草中的總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法獲得最佳提取工藝條件，并以蘆丁為對(duì)照，測(cè)定內(nèi)蒙紫草總黃酮對(duì)1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）的清除能力來判定其抗氧化活性，為其藥理學(xué)研究和野生資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

內(nèi)蒙紫草：購自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院中藥房，經(jīng)筆者鑒定為真品；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：麥克林公司，批號(hào)C10018061，純度＞99 %；DPPH：阿拉丁，批號(hào)40248；ABTS：阿拉丁，批號(hào)36567；石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀：均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

DW-500C密封搖擺式高速粉碎機(jī)：浙江省臺(tái)州市大畏機(jī)械廠；KQ-600DE超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；BL-2000S電子天平：美國(guó)Setra公司；R-200D精密電子天平：Sartorius公司；Lambda-35紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Perkin Elmer公司；Centrifuge 5810R離心機(jī)：Eppendorf AG公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[6]

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品31.50 mg，加60 %乙醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，量取25 mL于50 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，制成0.157 5 mg/mL蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于10 mL具塞試管中，分別加30 %乙醇至5 mL，加5 %NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6min，加4 % NaOH溶液4 mL，用水稀釋至10 mL，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），以濃度C對(duì)A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A = 9.899 8C + 0.005 7（R2=0.999 5），線性范圍0～0.078 mg/mL。

1.3.2總黃酮提取及含量測(cè)定

將紫草粉碎，過2號(hào)篩，加一定倍量石油醚超聲脫脂2次，濾渣烘干，備用。準(zhǔn)確稱取脫脂后紫草粉末1 g 于100 mL錐形瓶中，以一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，封口塞密封，浸泡過夜。在室溫下，超聲波輔助提取規(guī)定時(shí)間，離心，沉淀以同樣條件提取和離心，合并兩次上清液，并用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中[7]，取該溶液1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總黃酮得率。

式中：C為黃酮濃度，mg/mL；V1為測(cè)定時(shí)具塞試管中溶液體積，mL；V2為待測(cè)樣液分取的體積，mL；V3待測(cè)樣液的總體積，mL；W為脫脂后的樣品重，g。

1.3.3總黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素取3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。以總黃酮得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳提取條件，因素水平如表1。

1.3.4總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1DPPH自由基清除能力測(cè)定[8-10]

移取不同質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、 400、450 μg/mL）紫草總黃酮溶液各2.5 mL，各加入250 μg/mL DPPH溶液2.5 mL于具塞試管中，振蕩搖勻，黑暗處放置30min，于517 nm處測(cè)定A1；空白組以95 %乙醇代替樣品溶液，測(cè)定A0；對(duì)照組以95 %乙醇代替DPPH溶液，測(cè)定A2。以95 %乙醇調(diào)零，平行3次，用同樣濃度系列的蘆丁溶液作陽性對(duì)照。

表1　紫草總黃酮超聲提取工藝響應(yīng)面因素水平Table 1 Factors and levels used in RSM for total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

1.3.4.2ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[11-12]并做改進(jìn)，移取不同質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、400、450 μg/mL）紫草總黃酮溶液各0.3 mL，各加入ABTS+工作液3 mL于具塞試管中，振蕩搖勻，室溫暗處條件下反應(yīng)6min，于734 nm處測(cè)定A1；空白組以95 %乙醇代替樣品溶液，測(cè)定A0；對(duì)照組以95 %乙醇代替ABTS+工作液，測(cè)定A2。以95 %乙醇調(diào)零，平行3次，用同樣濃度系列的蘆丁溶液作陽性對(duì)照。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響

固定料液比1∶30（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %，超聲功率600 W，超聲時(shí)間0.5 h，考察提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of repeated extraction number on extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，提取次數(shù)從1次增加到2次，提取率升高幅度較明顯，繼續(xù)增加提取次數(shù)，提取率無明顯提高，這是因?yàn)榇藭r(shí)內(nèi)蒙紫草中殘留的黃酮類物質(zhì)已經(jīng)很少，故從減少操作環(huán)節(jié)，節(jié)約成本考慮，提取次數(shù)宜選擇2次。

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

固定料液比1∶30（g/mL），超聲功率600 W，超聲時(shí)間0.5 h，提取2次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，得率有一個(gè)先升后降的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %時(shí)得率達(dá)最高。這是因?yàn)榭傸S酮為極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，通過調(diào)節(jié)乙醇和水的配比改變乙醇溶液的極性，對(duì)總黃酮的提取效率有較大影響[13]，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %。

2.1.3料液比對(duì)總黃酮得率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，超聲功率600 W，超聲時(shí)間0.5 h，提取2次，考察料液比對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，隨著料液比增大，得率亦逐漸增大，當(dāng)料液比比達(dá)到1∶40（g/mL）時(shí)，再增大料液比，得率變化不大，這是因?yàn)榱弦罕?∶40（g/mL）時(shí)，黃酮類化合物的溶解基本達(dá)到完全。通過對(duì)得率、溶劑用量、能量耗損和后續(xù)工藝簡(jiǎn)化的綜合考慮，選擇料液比1:40 （g/mL）進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

固定料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，超聲時(shí)間0.5 h，提取2次，考察超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，隨著超聲功率增加，得率不斷上升，并在600 W時(shí)達(dá)到極大值，可能是由于超聲波的振動(dòng)，擊碎了紫草內(nèi)部細(xì)胞壁，加速了細(xì)胞內(nèi)部黃酮類物質(zhì)的浸出速率[14]，因此提取得率逐漸增大，故選擇超聲功率為600 W。

2.1.5超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

固定料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，超聲功率600 W，提取2次，考察超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction yield of total flavonoids

由圖5可知，在提取3 h前，總黃酮不能充分地轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著提取時(shí)間增加，總黃酮含量也增加，在3 h時(shí)達(dá)到峰值，之后，繼續(xù)增加時(shí)間，得率有所下降，這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，溫度急劇升高，導(dǎo)致總黃酮分解或揮發(fā)所致[13]，故選擇提取時(shí)間為3 h。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)組合與結(jié)果見表2；回歸模型的方差分析結(jié)果見表3；各因素之間對(duì)得率影響的響應(yīng)面和等高線見圖6、圖7、圖8。

表2　紫草總黃酮超聲提取工藝響應(yīng)面安排Table 2 Response surface design arrangement and experimental results for total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

表3　超聲提取工藝回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted regression model

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到A、B、C與紫草總黃酮得率的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=4.85-0.073A+0.18B+0.18C+0.022AB-0.032AC+ 0.029BC-0.3A2-0.3B2-0.15C2。

圖6　乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)紫草總黃酮得率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

圖7　乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對(duì)紫草總黃酮得率的影響Fig.7 Effects of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3，因變量和全體自變量的線性關(guān)系顯著（r=0.953 6），模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)＜0.05，此時(shí)二次多項(xiàng)回歸方差模型高度顯著，說明該試驗(yàn)方法可靠，可用此模型對(duì)超聲提取內(nèi)蒙紫草總黃酮的工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

圖8　料液比和超聲時(shí)間對(duì)紫草總黃酮得率的影響Fig.8 Effects of solid-liquid ratio and extraction time on extraction yield of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間對(duì)得率的影響。其響應(yīng)曲面及其等高線如圖6～圖8所示，3組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，以料液比、超聲時(shí)間影響較為顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[13]。比較3組圖并結(jié)合表3中P可知:模型的一次項(xiàng)A（P＞0.05）不顯著、B（P＜0.01）高度顯著，C（P＜0.05）顯著；交互項(xiàng)都不顯著；二次項(xiàng)A（P＜0.01）和B（P＜0.01）均高度顯著，表明各因素對(duì)得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其中，料液比、超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，表現(xiàn)為曲線較平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

綜上所述，根據(jù)回歸模型通過Design-Expert軟件分析得出，紫草總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.57 %，料液比1∶43.33（g/mL），超聲時(shí)間3.33 h。為實(shí)際操作方便，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)59 %，料液比1∶43 （g/mL），超聲時(shí)間3.3 h。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮平均得率4.91 %（RSD=1.46 %），與預(yù)測(cè)值4.94 %相差不大，說明該方程與實(shí)際情況擬合較好，所建模型正確，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3抗氧化活性測(cè)定

2.3.1DPPH自由基清除能力測(cè)定

不同濃度的內(nèi)蒙紫草總黃酮和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖9所示。

圖9　紫草總黃酮和蘆丁清除DPPH自由基的能力Fig.9 DPPH radical scavenging activities of total flavonoids and rutin

由圖9可知，紫草總黃酮和蘆丁對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算IC50（半數(shù)抑制濃度）值，兩者分別為66.76、33.19 μg/mL，表明紫草總黃酮清除DPPH自由基的能力弱于蘆丁，這可能是因?yàn)樽喜菘傸S酮為混合物，純度低，雜質(zhì)較多，抑制了其活性[15]。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

不同濃度的內(nèi)蒙紫草總黃酮和蘆丁對(duì)ABTS+自由基的清除作用如圖10所示。

圖10　紫草總黃酮和蘆丁清除ABTS+自由基的能力Fig.10 ABTS+radical scavenging activities of total flavonoids and rutin

由圖10可知，隨著紫草總黃酮和蘆丁質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS+的清除率亦隨之增大，呈現(xiàn)出較明顯的量效關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算IC50（半數(shù)抑制濃度）值，兩者分別為22.19、30.60 μg/mL，可見紫草總黃酮清除ABTS+自由基的能力稍強(qiáng)于蘆丁。

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定各因素的最佳水平，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對(duì)內(nèi)蒙紫草中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝修正條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、料液比1∶43（g/mL），超聲時(shí)間3.3h。在此條件下，經(jīng)3次試驗(yàn)驗(yàn)證，總黃酮平均得率4.91%，與模型預(yù)測(cè)值4.94 %非常接近。說明該工藝科學(xué)合理，安全有效，在黃酮類化合物提取過程中具有很好的應(yīng)用前景。

抗氧化試驗(yàn)表明，紫草總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH 和ABTS+的能力，其IC50相應(yīng)為66.76、22.19 μg/mL，分別是蘆丁的約2.01倍和0.73倍，可見紫草總黃酮清除DPPH自由基能力小于蘆丁，而清除ABTS+自由基的能力卻優(yōu)于蘆丁，且始終大于同質(zhì)量濃度下的蘆??；同質(zhì)量濃度的總黃酮對(duì)ABTS+自由基清除作用大于DPPH自由基，原因可能與提取物中黃酮結(jié)構(gòu)有關(guān)及對(duì)不同體系的抗氧化作用不同所致[16]。內(nèi)蒙紫草體外抗氧化活性成分，除與黃酮有關(guān)外，還可能與醇提物中復(fù)雜的其它成分有關(guān)[17]，至于抗氧化成分的種類、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

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Study on Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Arnebia guttata Bunge

LIN Hai-zhen，SHI Sheng-ying，LI Shu-jie，ZHOU Wei，LIN Jing-ming*
（Department of Pharmacy，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282，Guangdong，China）

Abstract：The objects of this study were to optimize extraction process and to research in vitro antioxidant activity of total flavonoids from Arnebia guttata Bunge.The extraction technology was optimized by single factor experiment and response surface methodology and the antioxidant effect was determined with rutin as positive control.The results had indicated that the extraction optimum technological conditions were the solid -liquid ratio 1∶43.33（g/mL），the concentration of ethanol 58.57 %，the extracting time 3.33 h，and the yield of total flavonoids was 4.94 %.

Key words：Arnebia guttata Bunge；total flavonoids；ultrasonic -assisted extraction；response surface methodology；antioxidant activity

DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.010

基金項(xiàng)目:廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013010014796）；海珠區(qū)科普計(jì)劃項(xiàng)目（2014HZKP-DS-2）

作者簡(jiǎn)介:林海楨（1988—），男（漢），在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的研究開發(fā)與臨床藥學(xué)研究。

*通信作者:林敬明（1963—），男（漢），教授，博士。

收稿日期:2015-12-17