齊海亮，安曉穎，李曉霞，宋鑫亮，齊科雷，董稚明

(1 河北省胸科醫(yī)院，石家莊050041；2 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

食管鱗癌組織miR-193b表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系

齊海亮1，安曉穎1，李曉霞1，宋鑫亮1，齊科雷1，董稚明2

(1 河北省胸科醫(yī)院，石家莊050041；2 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

目的 探討miRNA-193b(miR-193b)在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 采用SYBR Green qRT-PCR技術(shù)檢測56例食管鱗癌患者癌組織及癌旁正常組織miR-193b表達(dá)，分析癌組織miR-193b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 食管鱗癌組織miR-193b相對表達(dá)量為0.052±0.004，癌旁正常組織為0.089±0.005，二者比較P<0.01。食管鱗miR-193b表達(dá)與腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論 食管鱗癌組織miR-193b表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤TNM分期有關(guān)；miR-193b可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

食管鱗癌；微小RNA；微小RNA-193b

微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，能通過核酸序列的互補(bǔ)性結(jié)合到特定的靶mRNA上，并調(diào)節(jié)、翻譯或降解靶mRNA來調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可作為癌基因或抑癌基因，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3]。miRNA-193b(miR-193b)是miRNA家族成員之一，其表達(dá)變化與胃癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌等密切相關(guān)，但目前鮮見其與食管鱗癌關(guān)系的報道。2014年9月～2015年6月，我們觀察了食管鱗癌組織中miR-193b的表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期河北省胸科醫(yī)院手術(shù)切除的食管鱗癌組織及癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)各56例份，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷。患者男36例、女20例，年齡39～77歲、中位年齡60歲；組織分化程度：高、中分化23例，低分化33例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期16例。所有患者術(shù)前未行放療、化療及生物治療等。

1.2 食管鱗癌組織及癌旁正常組織miR-193b表達(dá)檢測 取食管鱗癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，TRIzol法提取組織總RNA。紫外分光光度計測定RNA的濃度、純度和完整性，經(jīng)檢測所提取的總RNA無降解，標(biāo)本合格，可用于后續(xù)實驗。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，其中總RNA 1.5 μL、特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物2 μL、RNA酶抑制劑1 μL、緩沖液4 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、DECP水8.5 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肞rimer Premier5.0軟件設(shè)計miR-193b和內(nèi)參基因U6的引物序列，由中國北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。按照TaqMan PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA模板2 μL、上下游引物各0.6 μL、2×taqman universal pcr master mix 10.0 μL、DECP水6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個樣本做3個復(fù)孔。記錄每個熒光反應(yīng)管中的熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，將原始數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，以U6為內(nèi)參，ΔCt=CtmiR-193b-CtU6。以2-ΔΔCt法計算miR-193b的相對表達(dá)量。分析食管鱗癌組織miR-193b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁正常組織miR-193b表達(dá)比較 癌組織miR-193b相對表達(dá)量為0.052±0.004，癌旁正常組織為0.089±0.005，兩者比較P<0.01。

2.2 食管鱗癌組織miR-193b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 食管鱗癌組織miR-193b表達(dá)與患者 臨床病理特征的關(guān)系±s)

3 討論

miRNA是一類非編碼小分子RNA，其主要功能是參與并調(diào)控基因的表達(dá)，通過識別靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)，抑制靶基因表達(dá)[4]。自從首個miRNA功能被確認(rèn)以來，miRNA已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。miRNA幾乎參與了所有的生物學(xué)過程，維系著生物正常基因表達(dá)和生理功能;其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致疾病的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物過程，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5，6]。

miR-193b的編碼基因位于人16號染色體上，是非編碼的小分子RNA。作為一種重要的調(diào)節(jié)因子，miR-193b參與了機(jī)體諸多生理病理過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-193b參與了軟骨的新陳代謝，隨著年齡增長其表達(dá)上調(diào)[8]；但Ⅱ型肌萎縮患者miR-193b-3p表達(dá)下調(diào)[9]；miR-193b在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，當(dāng)其過表達(dá)時可顯著降低肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力[10]。Rauhala等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-193b是前列腺癌的腫瘤抑制因子。Li等[12]報道，在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)下調(diào)miR-193b表達(dá)，可明顯增加尿纖維蛋白溶酶原激活物，進(jìn)而刺激瘤細(xì)胞的惡性表型發(fā)生。Lenarduzzi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在敲除頭頸部鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系的miR-193b基因，可使癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力提高，并且在體內(nèi)可抑制瘤細(xì)胞的形成。miR-193b在胃癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致uPA、STMN1、MMP-2、MMP-9等靶基因表達(dá)上調(diào)；而這些靶基因都是引起腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的主要分子。因此認(rèn)為，miR-193b在多種惡性腫瘤中起到負(fù)調(diào)控作用，可作為一種腫瘤抑制因子。但目前其在食管鱗癌組織中的表達(dá)鮮見報道。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織miR-193b的相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織；miR-193b表達(dá)與腫瘤TNM分期有關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。因此認(rèn)為，miR-193b在食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)可能引起某種促癌機(jī)制活化，導(dǎo)致食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展，但是其具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

[1] Cohn DE, Fabbri M, Valeri N, et al. Comprehensive miRNA profiling of surgically staged endometrial cancer[J]. Am J Obstet Gynecol, 2010,202(6):656.

[2] Zimmerman AL, Wu S. MicroRNAs, cancer and cancer stem cells[J]. Cancer Lett, 2011,300(1) :9-10.

[3] Zhang F, Yang Z, Cao M, et al. miR-203 suppresses tumor growth and invasion and down-regulates miR-21 expression through repressing Ran in esophageal cancer[J]. Cancer Lett, 2014,342(1):121-129.

[4] Huntzinqer E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nat Rev Genet, 2011,12(2):99-110.

[5] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):857-866.

[6] Li H, Zheng D, Zhang B, et al. miR-208 promotes cell proliferation by repressing SOX6 expression in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Transl Med, 2014(12):196.

[7] Gao XN, Lin J, Gao L, et al. MicroRNA-193b regulates c-Kit proto-oncogene and represses cell proliferation in acute myeloid leukemia[J]. Leuk Res, 2011,35(9):1226-1232.

[8] Ukai T, Sato M, Akutsu H, et al. MicroRNA-199a-3p, microR NA-193b, and microRNA-320c are correlated to aging and regulatehuman cartilage metabolism[J]. J Orthop Res, 2012,30(12):1915-1922.

[9] Greco S, Perfetti A, Fasanaro P, et al. Deregulated microRNAs inmyotonic dystrophy type 2[J]. PLoS One, 2012,7(6):e39732.

[10] Hu H, Li S, Liu J, et al. MicroRNA-193b modulates proliferation, migration and invasion of non-small cell lung cancer cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2012,44(5):424-430.

[11] Rauhala HE, Jalava SE, Isotalo J, et al. miR-193b is an epigenetically regulated putative tumor suppressor in prostate cancer[J]. Int J Cancer, 2010,127(6):1363-1372.

[12] Li XF, Yan PJ, Shao ZM. Downregulation of miR-193b contributes to enhance urokinase-type plasminogen activator (uPA) expression and tumor progression and invasion in human breast cancer[J]. Oncogene, 2009,28(44):3937-3948.

[13] Lenarduzzi M, Hui AB, Alajez NM, et al. MicroRNA-193b enhances tumor progression via down regulation of neurofibromin 1[J]. PLoS One, 2013,8(1):e53765.

河北省科技支撐計劃項目(132777221)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.026

R735.1

B

1002-266X(2016)32-0074-02

2015-12-21)