蔣春閃，呂游，陳金傳，孟祥圣，張劍，劉藝

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000；2徐州醫(yī)科大學(xué))

二十二碳六烯酸對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其機(jī)制

蔣春閃1，呂游1，陳金傳1，孟祥圣1，張劍2，劉藝1

(1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院，江蘇連云港222000；2徐州醫(yī)科大學(xué))

目的 觀(guān)察二十二碳六烯酸(DHA)對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法 將60只成年雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和觀(guān)察組，每組20只。模型組和觀(guān)察組制備脊髓損傷模型，假手術(shù)組只暴露但不損傷脊髓。造模后0.5 h，觀(guān)察組經(jīng)尾靜脈注射DHA 1 000 nmol/kg，連用3天。各組分別于造模前1天(t0)及造模后1天(t1)、3天(t2)、7天(t3)、21天(t4)，記錄斜板試驗(yàn)最大角度和脊髓損傷評(píng)分(BBB評(píng)分)；于T1～T4分別取5只大鼠，觀(guān)察脊髓病理形態(tài)，采用免疫組化法檢測(cè)脊髓神經(jīng)元核抗原(NeuN)與神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)。結(jié)果 模型組和觀(guān)察組T1～T4斜板試驗(yàn)最大角度及BBB評(píng)分均明顯低于T0和假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)，模型組T3、T4斜板試驗(yàn)最大角度及BBB評(píng)分均明顯低于觀(guān)察組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和觀(guān)察組T1～T4脊髓形態(tài)均發(fā)生病理性改變，觀(guān)察組較模型組病理性改變有所改善。與假手術(shù)組比較，模型組和觀(guān)察組T1～T4脊髓背角和腹角NeuN表達(dá)均降低，但模型組降低更明顯(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和觀(guān)察組T1～T4GFAP表達(dá)均升高，但模型組T3、T4升高更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 DHA能夠減輕脊髓損傷大鼠的病理?yè)p傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)；升高脊髓NeuN表達(dá)、降低GFAP表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

脊髓損傷；二十二碳六烯酸；神經(jīng)元核抗原；神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白；大鼠

脊髓損傷常導(dǎo)致嚴(yán)重傷殘，神經(jīng)修復(fù)與再生是脊髓損傷恢復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前其治療方法主要是手術(shù)減壓和大劑量甲強(qiáng)龍沖擊治療，但療效尚存在爭(zhēng)議[1～3]。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)主要包含二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和α-亞麻酸(ALA)，其中DHA廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞膜上，其含量占n-3 PUFAs的50%以上，對(duì)神經(jīng)修復(fù)與再生具有關(guān)鍵作用[4，5]。2015年3～10月，我們觀(guān)察了DHA對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠60只，健康清潔級(jí)，6～7周齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。試劑及儀器：DHA(Sigma公司，美國(guó))，Anti-NeuN試劑盒(Abcam公司，英國(guó))，Anti-GFAP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；BX41光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 模型制備及分組處理 將60只成年雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和觀(guān)察組，每組20只。模型組和觀(guān)察組采用改良Allen打擊法[6]制備脊髓損傷模型：兩組均以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪去術(shù)野背毛，常規(guī)消毒鋪巾。以胸椎T10為中心，取后正中切口約4 cm逐層切開(kāi)，剝離椎板兩旁肌肉，充分暴露T9～T11椎板及棘突；小心去除T9、T10椎板，充分顯露T10節(jié)段脊髓(約1.0 cm×0.6 cm)。在脊髓上置一塊薄明膠墊，以10 g打擊棒自10 cm處垂直自然下落，精確致傷明膠墊處脊髓，致傷能量約100 gcf(gram cm force)，打擊棒停留1 min后移開(kāi)。清洗、止血、縫合，肌注2.5萬(wàn)U/(kg·d)青霉素預(yù)防感染，連用3天。假手術(shù)組只暴露但不損傷脊髓。模型組和觀(guān)察組均出現(xiàn)雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，證實(shí)造模成功。各組術(shù)后每日早中晚按摩膀胱輔助排尿3次，直至恢復(fù)自主排尿。造模后0.5 h，觀(guān)察組參照Lim等[7]的方法經(jīng)尾靜脈注射DHA 1 000 nmol/kg，連用3天。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀(guān)察

1.3.1 神經(jīng)功能 各組分別于造模前1天(t0)及造模后1天d(t1)、3 天(t2)、7天(t3)、21天(t4)行斜板試驗(yàn)和脊髓損傷評(píng)分(BBB評(píng)分)。①斜板試驗(yàn)：將大鼠置于一長(zhǎng)方形帶橫紋膠墊木制斜板上，保持大鼠身體縱線(xiàn)與斜板縱軸垂直放置，逐漸升高斜板高度，記錄大鼠在斜板上停留5 s的最大角度，重復(fù)5次，取平均值。②BBB評(píng)分：將大鼠置于寬闊活動(dòng)場(chǎng)地自由活動(dòng)5 min，觀(guān)察其后肢運(yùn)動(dòng)、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放及尾巴的位置，對(duì)左右下肢分別評(píng)分并取平均值，滿(mǎn)分為21分。斜板試驗(yàn)和BBB評(píng)分均由兩位熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但不參與實(shí)驗(yàn)分組的人員進(jìn)行操作，斜板試驗(yàn)最大角度越大、BBB評(píng)分越高，說(shuō)明神經(jīng)功能越好。

1.3.2 脊髓病理形態(tài) 各組于t1～t4分別取5只大鼠，取仰臥位。經(jīng)左心房插管至主動(dòng)脈內(nèi)固定，剪開(kāi)右心耳，用生理鹽水灌注至右心耳流出澄清液體，再以4%多聚甲醛先快后慢灌注至大鼠四肢抽搐，尾巴僵直。取損傷中心上下約2 cm的脊髓，置于10%多聚甲醛中保存24 h，常規(guī)石蠟包埋。損傷中心連續(xù)橫斷切片10張，片厚約為5 μm。隨機(jī)選取3張脊髓橫斷面切片行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察脊髓病理形態(tài)。

1.3.3 脊髓神經(jīng)元核抗原(NeuN)和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá) 取各組t1～t4的脊髓橫斷面切片，采用免疫組化SP法檢測(cè)NeuN和GFAP表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以神經(jīng)細(xì)胞染成棕黃色定義為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)選取脊髓腹角與背角各3個(gè)不重疊的高倍視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)脊髓背角與腹角NeuN、GFAP陽(yáng)性顆粒平均分光光密度值(OD值)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 三組神經(jīng)功能比較 模型組和觀(guān)察組t1～t4斜板試驗(yàn)最大角度及BBB評(píng)分均明顯低于同組t0和假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)，模型組t3、t4斜板試驗(yàn)最大角度及BBB評(píng)分均明顯低于觀(guān)察組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 三組脊髓病理形態(tài)比較 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)脊髓形態(tài)完整，灰白質(zhì)分界清楚，神經(jīng)細(xì)胞呈典型多極神經(jīng)元，尼氏體分布均勻，白質(zhì)纖維走形正常。模型組t1可見(jiàn)彌漫性出血，神經(jīng)元明顯減少，灰白質(zhì)分界不清，白質(zhì)空泡明顯；t2出血相對(duì)減少，可見(jiàn)灰質(zhì)碎解，結(jié)構(gòu)消失，有膠質(zhì)細(xì)胞聚集；t3出血基本消失，神經(jīng)元固縮變形，核偏移，可見(jiàn)小空洞形成；t4神經(jīng)元減少，部分嗜酸性變，反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增多，白質(zhì)纖維走形紊亂，有形成膠質(zhì)瘢痕的趨勢(shì)。與模型組比較，觀(guān)察組相同時(shí)間點(diǎn)出血明顯減少，灰白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，可見(jiàn)神經(jīng)元水腫變性及白質(zhì)空泡；隨著時(shí)間推移，觀(guān)察組神經(jīng)細(xì)胞逐漸恢復(fù)為典型的多極神經(jīng)元形態(tài)，白質(zhì)空泡減少，結(jié)構(gòu)近乎正常。

表1 三組不同時(shí)間點(diǎn)斜板試驗(yàn)最大角度和 BBB評(píng)分比較

注：與同組t0比較，*P<0.05；與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05。

2.3 三組脊髓NeuN和GFAP表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組和觀(guān)察組t1～t4脊髓背角和腹角NeuN表達(dá)均降低，但模型組降低更明顯(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組和觀(guān)察組t1～t4GFAP表達(dá)均升高，但模型組t3、t4升高更明顯(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組脊髓NeuN和GFAP表達(dá)比較(OD值，

注：與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05。

3 討論

脊髓損傷包括神經(jīng)元及血管破壞引起的原發(fā)性損傷和一系列生化機(jī)制改變引起的繼發(fā)性損傷，二者共同導(dǎo)致神經(jīng)元的退變、壞死和膠質(zhì)細(xì)胞活化等病理反應(yīng)[8]。研究表明，DHA可以通過(guò)多種抗炎機(jī)制減少損傷后神經(jīng)元的丟失，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生[9,10]。DHA屬于n-3多不飽和脂肪酸的一種，有“腦黃金”之美譽(yù)，主要從深海魚(yú)油和藻類(lèi)中提煉，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)多不飽和脂肪酸的主要成分，可促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育[11]。DHA具有高度不飽和性，可以增加神經(jīng)元細(xì)胞膜的流動(dòng)性，在神經(jīng)元的生化反應(yīng)中具有重要作用。Pu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs 可改變腦損傷小鼠神經(jīng)細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)，與花生四烯酸競(jìng)爭(zhēng)代謝，減輕炎癥介質(zhì)的釋放，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化與興奮性神經(jīng)毒性，減少神經(jīng)元的丟失與脫髓鞘變化。本研究觀(guān)察組神經(jīng)功能較模型組明顯提高，說(shuō)明DHA可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)； 觀(guān)察組脊髓組織出血、水腫及滲出、壞死情況較模型組有明顯改善，說(shuō)明DHA可減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，抑制脊髓繼發(fā)性損害。

脊髓損傷后成熟神經(jīng)元的數(shù)量可直接反映神經(jīng)功能狀態(tài)。NeuN是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，有46、48 kD兩個(gè)亞型，分別在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)[13]。脊髓損傷后即可發(fā)生神經(jīng)元的變性、壞死和凋亡，NeuN蛋白可反映神經(jīng)元存活狀態(tài)。打擊傷可對(duì)直接打擊側(cè)(背角)與間接打擊側(cè)(腹角)均造成損傷，因此本研究采用NeuN蛋白評(píng)價(jià)神經(jīng)元的損傷程度。結(jié)果顯示，與模型組比較，觀(guān)察組脊髓背角與腹角NeuN蛋白表達(dá)均顯著增高，說(shuō)明DHA可促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)與再生。

GFAP是活化星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)水平可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞是形成膠質(zhì)瘢痕的主要因素，但其活化后聚集于損傷組織周?chē)梢苑置谝幌盗屑?xì)胞因子，改善損傷組織的微環(huán)境，有利于損傷區(qū)域神經(jīng)元的修復(fù)與再生[14]。GFAP在脊髓損傷后廣泛分布，區(qū)域性分布并不顯著。因此，本研究未分別觀(guān)察脊髓背角與腹角GFAP表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，觀(guān)察組GFAP表達(dá)均降低，且t3、t4降低更明顯?？紤]到模型組早期神經(jīng)元大量變性壞死，相對(duì)于觀(guān)察組應(yīng)有大量星形膠質(zhì)細(xì)胞活化聚集，但本研究結(jié)果顯示模型組早期星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度并不明顯強(qiáng)于觀(guān)察組。我們猜測(cè)雖然DHA可以減少GFAP表達(dá)，在一定程度上抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，但在早期可能對(duì)其活化有一定的促進(jìn)作用。但是目前尚無(wú)研究報(bào)道證實(shí)，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，DHA能促進(jìn)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與升高脊髓NeuN表達(dá)、降低GFAP表達(dá)有關(guān)。

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劉藝(E-mail： 80600026@qq.com)

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R651.2

A

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2015-11-22)