王宇，王琪，杜明昌，劉銘，劉欣偉，張玉彪，劉松波，劉憲民，項良碧

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽110016)

·論著·

ADSCs和β-TCP復(fù)合支架制備及其對豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ、Sox-9表達的影響

王宇，王琪，杜明昌，劉銘，劉欣偉，張玉彪，劉松波，劉憲民，項良碧

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽110016)

目的 制備豬脂肪干細胞(ADSCs)和β-磷酸三鈣(β-TCP)復(fù)合支架，觀察其對豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ和Sox-9表達的影響。方法 取1只巴馬小型仔豬的頸部皮下脂肪組織，分離并鑒定ADSCs。以β-TCP作為支架材料，將其制成12個圓柱體支架，隨機選擇其中6個進行成骨誘導(dǎo)。將12個支架與ADSCs復(fù)合培養(yǎng)，制備復(fù)合支架，對經(jīng)成骨誘導(dǎo)后復(fù)合支架上的ADSCs進行茜素紅和堿性磷酸酶染色。將18只巴馬小型豬隨機分為空白對照組、支架組、成骨誘導(dǎo)支架組，每組6只。支架組、成骨誘導(dǎo)支架組制備與支架大小相符的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，并分別植入未經(jīng)過、經(jīng)過成骨誘導(dǎo)的復(fù)合支架；空白對照組切開膝關(guān)節(jié)后直接縫合，不進行其他處理。各組常規(guī)飼養(yǎng)4周后處死，取缺損處軟骨組織，采用熒光定量PCR法檢測CollagenⅡ mRNA和Sox-9 mRNA相對表達量，Western blotting法檢測CollagenⅡ蛋白和Sox-9蛋白相對表達量。結(jié)果 分離提取的ADSCs在分離初期鏡下顯示為圓形單個細胞，細胞的邊緣比較清楚，細胞貼壁并形成均勻分布的細胞。免疫組化染色顯示，分離的細胞CD44和CD105表達均為陽性，證明其為ADSCs。與空白對照組比較，支架組和成骨誘導(dǎo)支架組軟骨組織CollagenⅡ和Sox-9 mRNA及蛋白相對表達量均降低，但支架組降低更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 成功制備了ADSCs和β-TCP的復(fù)合支架；該支架經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可提高豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ和Sox-9的表達。

軟骨缺損；膝關(guān)節(jié)；軟骨下骨；β-磷酸三鈣；脂肪干細胞；復(fù)合支架；豬

脂肪干細胞(ADSCs)是來源于脂肪組織中的具有多向分化潛能的成體干細胞。研究表明，ADSCs與骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)具有相同的干細胞特征，包括不斷的自我更新和多向分化潛能[1,2]。ADSCs具有全身分布廣泛、容易獲取、對機體損傷小以及容易為患者所接受等特點，已成為近年來干細胞研究的熱點之一，逐漸成為組織工程種子細胞的新來源[3]。2013年7月～2015年9月，本研究制備豬ADSCs與β-磷酸三鈣(β-TCP)的復(fù)合支架，并植入豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損部位，觀察其對軟骨缺損組織CollagenⅡ、Sox-9表達的影響，以期為膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 巴馬小型仔豬19只，2日齡，雌雄不限，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物醫(yī)學(xué)實驗科提供。Ⅰ型膠原酶購于美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶、青鏈霉素均購于美國Hyclone公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TAKARA公司，熒光定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 ADSCs分離及鑒定

1.2.1 ADSCs分離 隨機選擇1只仔豬處死。無菌條件下切開仔豬頸部，取頸部皮下脂肪組織5 g，用Hanks′液浸泡沖洗3次；使用醫(yī)用眼科剪刀將脂肪組織上的肌肉和血管剔除，將脂肪組織剪成泥狀。加入0.1%Ⅰ型膠原酶轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，放入CO2培養(yǎng)箱中消化90 min，消化期間不時振蕩離心管，使其充分消化。將消化液過200目細胞篩，取濾液，3 000 r/min離心10 min。離心后棄去漂浮在離心管上面的脂肪細胞和上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基將離心管下面的細胞吹打均勻，以1×105個/mL接種于培養(yǎng)皿中，10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。光鏡下觀察細胞生長情況。結(jié)果顯示分離提取的未貼壁的ADSCs初期為圓形單個細胞，細胞邊緣比較清楚，細胞貼壁生長后分布均勻(見插頁Ⅰ圖1A、B)。

1.2.2 ADSCs鑒定 采用免疫組化法。取第3代ADSCs，以1×105個/孔接種于24孔板中。將蓋玻片放入細胞培養(yǎng)板中，待細胞爬片生長至70%～90%融合時，PBS洗3次；無水乙醇脫水，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗4 ℃孵育1 h，行免疫組化染色；鏡下觀察染色成功后用PBS沖洗，封片鏡檢。鏡下觀察ADSCs表型CD44、CD105的染色情況，以細胞染色呈棕黃色定義為陽性。免疫組化染色顯示分離的細胞CD44和CD105表達均為陽性，證明其為ADSCs(見插頁Ⅰ圖1C、D)。

1.3 ADSCs和β-TCP復(fù)合支架制備及成骨誘導(dǎo)鑒定

1.3.1 成骨誘導(dǎo)及復(fù)合支架制備 以β-TCP作為支架材料，將其制成直徑10 mm、高4 mm的圓柱體，共12個。隨機選擇其中6個進行成骨誘導(dǎo)：參照黃宏等[4]的方法配制成骨誘導(dǎo)劑，在支架中添加成骨誘導(dǎo)劑至支架充分浸泡，預(yù)冷后放入凍干機進行冷凍干燥。另外6個圓柱體支架材料不進行成骨誘導(dǎo)。所有支架在應(yīng)用前采用培養(yǎng)基浸泡過夜，將預(yù)濕的支架置于24孔板中，每孔1個支架，共8個復(fù)孔。取傳到第3代的ADSCs，0.25%胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，用微量加樣器將100 μL ADSCs懸液逐滴滴加在支架的中心部位。將孔板放入孵箱中37 ℃孵育2 h，使細胞充分擴散到支架上。取1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基填滿每個孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱中進行復(fù)合培養(yǎng)，培養(yǎng)3周完成復(fù)合支架的制備。

1.3.2 成骨誘導(dǎo)鑒定 取經(jīng)成骨誘導(dǎo)后復(fù)合支架上的ADSCs，分成兩個培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。其中一個培養(yǎng)皿培養(yǎng)15天左右，鏡下觀察產(chǎn)生鈣結(jié)節(jié)后參照茜素紅染色試劑盒說明進行染色、封片；另一個培養(yǎng)皿參照堿性磷酸酶染色試劑盒說明進行染色、封片。在生物顯微鏡下觀察，茜素紅染色后鈣結(jié)節(jié)呈紅色定義為陽性，堿性磷酸酶染色后細胞核呈藍色定義為陽性。結(jié)果顯示經(jīng)成骨誘導(dǎo)后復(fù)合支架上的ADSCs堿性磷酸酶和茜素紅染色均為陽性，證明成功將ADSCs誘導(dǎo)為成骨細胞(見插頁Ⅰ圖1E、F)。

1.4 復(fù)合支架對豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ、Sox-9表達影響的觀察

1.4.1 造模與分組處理 將剩余18只巴馬小型仔豬交由黑龍江省雙鴨山市科技小型豬養(yǎng)殖場飼養(yǎng)至6月齡，體質(zhì)量20～25 kg。將其隨機分為空白對照組、支架組、成骨誘導(dǎo)支架組，每組6只。支架組、成骨誘導(dǎo)支架組取仰臥位，由耳淺表靜脈注入氯胺酮溶液10 mg/kg。取膝關(guān)節(jié)正中切口，由髕骨內(nèi)側(cè)進入關(guān)節(jié)腔，顯露關(guān)節(jié)軟骨，分別在內(nèi)、外髁用空心鉆制作一個直徑10 mm、深4 mm的圓柱形軟骨缺損區(qū)，深達軟骨下骨，建立膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。支架組植入未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的復(fù)合支架，成骨誘導(dǎo)支架組植入經(jīng)成骨誘導(dǎo)的復(fù)合支架，植入后進行縫合?？瞻讓φ战M切開膝關(guān)節(jié)后直接縫合，不進行其他處理。各組常規(guī)飼養(yǎng)4周后處死，取損傷處軟骨組織進行以下實驗。

1.4.2 軟骨組織CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA表達 采用熒光定量PCR法。取軟骨組織放入液氮中進行研磨，加入TRIzol試劑，提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。CollagenⅡ上游引物：5′-TCCCCGGCACTCCTGGCACTGAT-3′，下游引物：5′-CTTGGGCACCTCGGGCTCCTTTAG-3′，片段長度136 bp；Sox-9上游引物：5′-GCCCTGTGTCTAAGAAGAGA-3′，下游引物：5′-AAAACAGAGAACGAAACCAG -3′，片段長度168 bp。以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′，下游引物：5′-AGGCATACAGGGACAACACAGC-3′，片段長度145 bp。反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，變性、退火和延伸共40個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法計算CollagenⅡ mRNA和Sox-9 mRNA相對表達量。

1.4.3 軟骨組織CollagenⅡ蛋白及Sox-9蛋白表達 采用Western blotting法。采用勻漿機將軟骨組織制成勻漿，加入蛋白裂解液，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，放入酶標儀中，根據(jù)試劑盒說明書繪制標準曲線。對所提取的蛋白進行定量和垂直電泳，70 V電壓使蛋白跑到分離膠與濃縮膠界面處，將電壓改為100 V，使膠體內(nèi)的藍色條帶跑至分離膠底部時，完成電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，加入一抗于4 ℃環(huán)境中孵育過夜，加入二抗室溫孵育，顯影定影，拍照。以β-actin為內(nèi)參，采用ImageJ軟件進行灰度值分析。以目的蛋白和β-actin灰度值的比值計算CollagenⅡ蛋白和及Sox-9蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨組織CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA相對表達量比較 與空白對照組比較，支架組和成骨誘導(dǎo)支架組軟骨組織CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA相對表達量均降低，但支架組降低更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨組織CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA 相對表達量比較±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與支架組比較，#P<0.05。

2.2 各組軟骨組織CollagenⅡ蛋白及Sox-9 蛋白相對表達量比較 與空白對照組比較，支架組和成骨誘導(dǎo)支架組軟骨組織CollagenⅡ蛋白及Sox-9蛋白相對表達量均降低，但支架組降低更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組軟骨組織CollagenⅡ蛋白及Sox-9 蛋白 相對表達量比較±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與支架組比較，#P<0.05。

3 討論

脂肪組織是主要的能量代謝場所之一，幾乎遍布于動物全身，在整個生命過程中有極強的可塑性；不僅是能量儲存庫，還能分泌多種因子，可通過內(nèi)分泌和旁分泌途徑發(fā)揮調(diào)控作用[5,6]。近年來，復(fù)合支架逐漸應(yīng)用于骨科疾病的治療，并獲得較好療效。應(yīng)用于復(fù)合支架的種子細胞應(yīng)具備以下條件：①具有特定的分化表型或定向分化潛能；②可靠的細胞來源；③不引發(fā)移植排斥反應(yīng)。ADSCs是從脂肪組織中分離得到的，不僅來源豐富，對患者損傷較小，易于從自身獲取，而且符合種子細胞的相關(guān)要求。

目前研究已證實，ADSCs與骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)干細胞(MSCs)不僅具有相同的表面黏附因子和受體分子，同樣也能分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和成肌細胞。ADSCs有可能替代MSCs成為組織工程種子細胞的新來源[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Sox-9基因過表達能抑制軟骨細胞繼續(xù)肥大并骨化，從而獲得豐富且穩(wěn)定存在的軟骨組織。體外動物實驗結(jié)果表明，Sox-9基因轉(zhuǎn)染后的MSCs發(fā)生了軟骨細胞方向的分化，部分動物實驗證實轉(zhuǎn)染后的MSCs形成了新的軟骨組織，并能在體內(nèi)長期存在[8～10]。軟骨細胞基質(zhì)中最多的CollagenⅡ能維持其基本形態(tài)，且CollagenⅡ能夠促進軟骨細胞分泌糖胺多糖及細胞因子[11,12]。

近年來研究證實，ADSCs與同樣來源于中胚層的MSCs比較，在干細胞產(chǎn)量、生長動力學(xué)、細胞衰老、多向分化潛能及轉(zhuǎn)染外源基因效率上無顯著差異[13～15]。有研究將ADSCs復(fù)合在可緩釋誘導(dǎo)因子Ⅰ型膠原海綿支架上，并將其移植修復(fù)軟骨缺損組織，患者術(shù)后4個月軟骨缺損部位完全修復(fù)，并形成透明軟骨組織[16]。本研究成功分離得到ADSCs，并通過其表型CD44和CD105陽性得到鑒定；同時經(jīng)成骨誘導(dǎo)后復(fù)合支架上的ADSCs堿性磷酸酶和茜素紅染色均為陽性，證明成功將ADSCs誘導(dǎo)成為成骨細胞。同時本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，支架組和成骨誘導(dǎo)支架組軟骨組織CollagenⅡ mRNA、Sox-9 mRNA及其蛋白相對表達量均降低，但支架組降低更明顯。說明經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的ADSCs和β-TCP復(fù)合支架可提高豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ和Sox-9表達，對軟骨損傷具有促進愈合的作用。

綜上所述，本研究成功制備了ADSCs和β-TCP的復(fù)合支架；該支架經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可提高豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損組織CollagenⅡ和Sox-9的表達。本研究為ADSCs和β-TCP復(fù)合支架治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了新的方向，但觀察時間比較短，未來需延長觀察時間并進行長期隨訪，進一步驗證其治療效果。

[1] Mashhadikhan M, Soleimani M, Parivar K, et al. ADSCs on PLLA/PCL hybrid nanoscaffold and gelatin modification: cytocompatibility and mechanical properties[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2015,7(1):32-38.

[2] 杜明昌,劉憲民,祖啟明,等.自體脂肪干細胞復(fù)合不同初始濃度誘導(dǎo)支架修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的初步觀察[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2013,7(6):2523-2527.

[3] 劉憲民,杜明昌,劉松波,等.一期獲取自體脂肪干細胞復(fù)合可緩釋誘導(dǎo)因子支架修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的初步研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2012,14(7):608-613.

[4] 黃宏,朱方強,王正國,等.脂肪來源干細胞體外成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)分化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014,30(13)：1129-1123.

[5] Zhou L, Xia J, Qiu X, et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis[J]. PLoS One, 2015,10(2):e0117644.

[6] Shukla L, Morrison WA, Shayan R. Adipose-derived stem cells in radiotherapy injury: a new frontier[J]. Front Surg, 2015,28(2):1.

[7] Koz′ lik M, Wójcicki P. The use of stem cells in plastic and reconstructive surgery[J]. Adv Clin Exp Med, 2014,23(6):1011-1017.

[8] 袁哲,裴新紅,馬瑞雪.Sox9 促進間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的研究進展[J].醫(yī)學(xué)信息,2014,27(3):564-565.

[9] Ham O, Song BW, Lee SY, et al. The role of microRNA -23b in the differentiation of MSC into chondrocyte by targeting protein kinase a signaling[J]. Biomaterials, 2012,33(18):4500-4507.

[10] Kanazawa T, Furumatsu T, Hachioji M, et al. Mechanical stretch enhances COL2A1 expression on chromatin by inducing SOX9 nuclear translocalization in inner meniscus cells[J]. J Orthop Res, 2012,30(3):468-474.

[11] Qi WN, Scully SP. Extracelluar collagen regulates expressionof transforming growth factorth factor-betal gene[J]. J OrthopRes, 2000,18(6):928-932.

[12] Tew SR, Murdoch AD, Rauchenberg RP, et al. Cellular methodsin cartilage research: primary human chondrocytes in cultureand chondrogenesis in human bone marrow stem cells[J]. Methods, 2008,45(1):2-9.

[13] García-Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, et al. Therapeutic potential of human adipose-derived stem cells (ADSCs) from cancer patients: a pilot study[J]. PLoS One, 2014,9(11):e113288.

[14] Ueda T, Fujita A, Ogawa R, et al. Adipose-derived stromal cells grown on a hydroxyapatite scaffold can support hematopoiesis in regenerated bone marrow in vivo[J]. Cell Biol Int, 2014,38(6):790-798.

[15] Zhang Y, Yu M, Tian W. Physiological and pathological impact of exosomes of adipose tissue[J]. Cell Prolif, 2015,49(1):3-13.

[16] 劉憲民,杜明昌,柳椰,等.豬膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損、軟骨下骨損傷后滑液中炎性因子水平變化[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué)2015,3(1):9-12.

Preparation of ADSCs composite scaffold and its effect on CollagenⅡ and Sox-9 expression in pigs with knee articular cartilage defects

WANGYu,WANGQi,DUMingchang,LIUMing,LIUXinwei,ZHANGYubiao,LIUSongbo,LIUXianmin,XIANGLiangbi

(GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommandofChinesePLA,Shenyang110016,China)

Objective To prepare the composite scaffold of porcine adipose stem cells (ADSCs) and β-tricalcium phosphate (β-TCP), and then to observe its effect on CollagenⅡ and Sox-9 expression in pigs with articular cartilage defects. Methods The ADSCs were extracted from subcutaneous adipose tissues of one Bama miniature pig, cells were observed under microscopy, and the expression of CD44, CD105 was detected by immunohistochemical staining. We took β-TCP as scaffolds to make 12 cylindrical stents, then 6 of which were randomly selected for osteogenic induction. The 12 stents and ADSCs were co-cultured to prepare the ADSCs composite scaffolds. ADSCs after osteogenic induction received the Alizarin red and alkaline phosphatase staining. Eighteen Bama miniature pigs were randomly divided into the control group, the stent group and osteogenic stent group, 6 in each. The knee cartilage defect models matched to stent size were prepared in the stent group and osteogenic stent group, then were implanted into the ADSCs composite scaffolds with or without osteogenic induction. In the control group, we directly sutured the incision after knee cut without any other treatment. The pigs were sacrificed after four-week regular feeding in each group, and we took the cartilage lesions. The fluorogenic quantitative PCR and Western blotting was used to detect the mRNA and protein expression of CollagenⅡ and Sox-9 in the cartilage tissues. Results Under microscope, ADSCs in the early separation were circular single cells, and the cell edge was more clear, and adherent cells formed uniformly. Immunohistochemical staining showed that CD44 and CD105 expression was positive in the isolated cells, which demonstrated they were ADSCs. Compared with the control group, the mRNA and protein expression levels of CollagenⅡ and Sox-9 were decreased in the stent group and osteogenic stent group, but the decrease was more significant in the stent group (allP<0.05). Conclusion ADSCs and β-TCP material composite scaffold was successfully prepared, and the scaffold after osteogenic induction can increase the expression of CollagenⅡ and Sox-9 in pig knee cartilage defect tissues.

cartilage defects; knee; subchondral bone; β-trical ciun phosphate; adipose stem cells; scaffold; swine

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2013020175)；遼寧省科技攻關(guān)項目(2013225089)。

王宇(1983-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為運動關(guān)節(jié)疾病。E-mail: luzongguke@163.com

劉憲民(1954-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為運動關(guān)節(jié)疾病。E-mail: Surgeon_du@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.001

R687.3

A

1002-266X(2016)32-0001-04

2015-12-14)