劉小寧，李元媛，甘宜敏，陳鳳麗，衡春，于亮

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇淮安223300)

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急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因檢測的臨床意義

劉小寧，李元媛，甘宜敏，陳鳳麗，衡春，于亮

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇淮安223300)

摘要:目的探討熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測PML/RARα融合基因在急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）診斷中的應(yīng)用價值。方法應(yīng)用常規(guī)細胞遺傳學(xué)分析28例APL患者的染色體核型，同時用FISH法檢測PML/RARα融合基因。結(jié)果28例初診的APL患者254例常規(guī)核型分析檢出t(15；17)（q22；q12）；2例患者核型正常；另1例未檢出t(15；17)，核型分析結(jié)果為涉及15和17號染色體的復(fù)雜異常；FISH檢測所有病例均存在PML/RARα融合基因。結(jié)論FISH法行PML/RARα融合基因檢測特異性和敏感性好，是診斷APL的可靠方法。

關(guān)鍵詞：急性早幼粒細胞白血??；PML/RARα融合基因；熒光原位雜交技術(shù)（FISH）；染色體

急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）是急性白血病中的一種特殊類型，其臨床特點是出血傾向嚴重，常易并發(fā)DIC及原發(fā)性纖溶亢進，早期病死率高，所以，APL早期診斷和及早治療至關(guān)重要?，F(xiàn)已明確，t(15；17)是APL特征性染色體異常，并在分子水平上導(dǎo)致PML/RARα融合基因形成[1]。為進一步明確臨床上表現(xiàn)為APL特征的患者，我們經(jīng)過對住院治療的28例APL患者進行染色體和PML/ RARα融合基因的檢查，以探討他們在APL診斷中的應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1對象一般資料選取2009年1月至2011年3月在我院血液科初診的28例APL患者，其中男16例，女12例，年齡14～82歲，平均年齡39.6歲。所有患者初診時均有臨床癥狀，并經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及組化染色初步診斷為APL。正常對照選用5例血液系統(tǒng)正常者的骨髓標本。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析取治療前患者和正常對照組的骨髓細胞（肝素抗凝），采用直接法和24h短期培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞，按常規(guī)方法收獲細胞，用R顯帶進行核型分析，染色體異常按《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2005ISCN2013）》的有關(guān)規(guī)定加以描述[2]。剩余細胞懸液凍存于－20℃冰箱內(nèi)以供FISH檢測。

1.2.2熒光原位雜交（FISH）檢測

1.2.2.1融合基因探針雙色融合（PML/RARα）探針購自Vysis公司，－20℃保存?zhèn)溆?。PML和RARα分別應(yīng)用SpectrumOrange和SpectrumGreen兩種熒光素標記。

1.2.2.2雜交取儲存于－20℃的骨髓細胞懸液，更換新鮮的甲醇/冰醋酸（3：1）固定液，滴片，晾干，過夜老化。加探針混合物，蓋片，封膠，置雜交儀濕盒中變性雜交。變性：72℃，2min；雜交：37℃，16～24h。次日將雜交后標本依次浸入72℃0.4×SSC、2×SSC/ 0.1%NP40中漂洗，避光晾干后加DAPI復(fù)染，封片。

1.2.2.3熒光顯微鏡檢查應(yīng)用熒光顯微鏡在DAPI/FITC濾色鏡的激發(fā)下觀察間期細胞的熒光雜交信號。正常細胞為：2個紅色2個綠色彼此分離的4個熒光信號；伴有t(15；17)染色體易位的細胞核中可見1個紅色、1個綠色和2個黃色融合信號；正常對照組取值方法參考有關(guān)文獻[3，4]，以大于x+3s作為陽性標準，PML/RARα的陽性標準為＞2.56%。每例至少分析200個細胞，計算陽性細胞百分比。

2　結(jié)果

2.1染色體核型分析結(jié)果染色體分析28例患者中25例檢出t(15；17)，陽性率為89.3%；2例染色體核型結(jié)果正常；另1例未檢出t(15；17)，但核型分析為涉及15和17號染色體的復(fù)雜異常核型。對照組5例核型分析結(jié)果均正常。見（表1、圖1。）

表1　28例APL患者與對照組核型

圖1　核型分析結(jié)果圖

2.2 FISH檢測結(jié)果28例APL患者經(jīng)FISH檢測均發(fā)現(xiàn)有PML/RARα融合基因存在。見表2、圖2。

3　討論

APL是一種特殊類型的白血病，具有相對特異的形態(tài)學(xué)特征及細胞分子遺傳學(xué)特征，其形態(tài)特征為胞漿含有大量顆粒的異常早幼粒細胞，細胞分子遺傳學(xué)特征為染色體檢查可見特異的t(15；17)，該易位導(dǎo)致17q的維甲酸受體α（RARα）基因與位于15q上的早幼粒細胞白血?。≒ML）基因融合，形成了PML/RARα融合基因，后者產(chǎn)生的PML/RARα融合蛋白通過一系列信號途徑，使造血干細胞分化阻斷在早幼粒階段而發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化[5]。

表2　FISH法檢測PML/RARα

圖2　FISH檢測結(jié)果圖

以往APL的診斷通常依靠細胞形態(tài)學(xué)及常規(guī)染色體檢查，但由于骨髓早階段細胞形態(tài)有相似之處，且少數(shù)變異型APL（M3v）形態(tài)學(xué)不典型，因此形態(tài)學(xué)有時難以診斷APL；常規(guī)染色體檢測也是常用的手段，約85%的APL可檢出t(15；17)，然而臨床上仍有15%左右的病例由于核型分析的中期細胞數(shù)量少、質(zhì)量差或15；17隱匿性及變異型易位而導(dǎo)致t(15；17)漏檢[6]。我們總結(jié)28例APL患者，有89.3%的患者通過常規(guī)染色體核型分析檢出t(15；17)，與文獻報道結(jié)果相似[7]；28例APL中有2例患者的核型正常，另1例APL的核型分析未檢出t(15；17)，只檢測到涉及15號和17號異常的復(fù)雜核型，但其臨床癥狀和細胞形態(tài)學(xué)支持APL的診斷，染色體核型結(jié)果不能排除15；17隱匿性及變異型易位。由此可見常規(guī)細胞遺傳學(xué)結(jié)果并不能全面反映APL群體，核型分析有時難以肯定是否伴有特征性分子異常，因此我們對上述標本進行了分子生物學(xué)的檢測。

分子檢測手段包括RT－PCR、Southern雜交、Northern雜交、FISH等技術(shù)。臨床上檢測PML/ RARα常用熒光定量RT－PCR技術(shù)[8]R，T－PCR技術(shù)其盡管敏感性高，但易出現(xiàn)假陰性和假陽性，引物的設(shè)計也影響檢出[9，10]。Southern和Northern雜交技術(shù)操作過程繁瑣，不適宜常規(guī)臨床檢測。FISH技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種較理想的快速、可定量檢測方法，在本組研究中的初診APL患者PML/RARα融合基因檢出率為28/28（100%），高于常規(guī)核型的陽性檢出率24/28(89.3%)，核型檢出t (15；17)的25例患者PML/RARα融合基因均陽性；本組的2例核型正?；颊逷ML/RARα融合基因亦為陽性，表明他們是隱匿性t(15；17)易位的APL；另1例累及15、17號染色體的復(fù)雜核型經(jīng)FISH檢測除PML/RARα融合基因陽性外，發(fā)現(xiàn)易位還涉及15、17號之外的第3條染色體，提示不典型的FISH信號模式的患者存在更為復(fù)雜的遺傳學(xué)異常[11]。結(jié)果提示其為復(fù)雜變異易位。由此可見FISH法檢測PML/RARα融合基因的敏感性及特異性均優(yōu)于常規(guī)細胞遺傳學(xué)，尤其對于核型檢測正常和具有復(fù)雜變異易位的病例起到了明確診斷的作用[12]。

臨床上凡具有t(15；17)易位或有PML/RARα融合基因的APL對維甲酸和砷制劑治療有效，但還有少數(shù)APL患者伴有變異型染色體易位如t(5；17)，t (11；17)等，這類患者對維甲酸治療反映差[13，14]，故準確檢測t(15；17)易位和PML/RARα融合基因?qū)τ贏PL診斷、指導(dǎo)治療有重要的指導(dǎo)作用，鑒于FISH法檢測t(15；17)易位形成的PML/RARα融合基因高靈敏度，在APL的診斷中具有重要價值，而染色體核型分析和FISH兩種檢測方法同時應(yīng)用具有一定的互補性[15]。而PML/RARα融合基因在APL的預(yù)后判斷及治療效果方面的意義還值得我們進一步研究。

參考文獻

[1]Biondi A，Rambaldi A，Alcalay M，et al．RAR -alpha gene rearrangements as a genetic nlal'ker for diagnosis and monitoring in acute promyelocytic leukemia[J]．Blood，1991，77(7)：l418-1422．

[2]Shaffer LG，McGowan -Jordan J，Schmid M，editors ISCN：an in-Tommerup N.eds. ISCN：An International System for Human Cytogenetic Nomenclature[M]. Karger S. Basel，2013.

[3]Mancini M，Nanni M，Cedrone M，et al. Combined cytogenetic，F(xiàn)ISH and molecular analysis in acute promyelocytic leukaemia at diagnosis and in complete remission [J]. Br J Haematol，1995，91 (4)：878.

[4]Chauffaille ML，F(xiàn)igueiredo MS，Beltrani R，et al. Acute promyelocytic leukemia；the study of t (15；17) translocation by fluorescent in situ hybridization，reverse transcriptase-polymerase chain reaction and cytogenetic techniques [J]. Braz J Med Biol Res，2001，34 (6)：735.

[5]Allford S，Grimwade D，Langabeer S，et al. Identification of the t (15；17)in AMLFAB types other than M3：evaluation of the role of molecular screening for the PML/RARαlpha rearrangement in newly diagnosed AML[J]. Br J Haematol，1999，105(1)：198.

[6]Grimwade D. The pathogenesis of acute promyeloocytic leukemia：evaluation of the role of molecular diagnosis and monitoring in the managrment of the disease[J]. Br J Haematol，1999，160：591-613.

[7]薛永權(quán).白血病細胞遺傳學(xué)及圖譜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2003：55-56.

[8]江梅，萬臘根，簡正偉，等.檢測PML/RARα基因的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30(5)：433-436.

[9]Amare PS，Baisane C，Saikia T，et al. Fluorescence in situhybridization：a highly efficient of molecular diagnosis and predication for disease course in patients with myeloid leukemias[J]. Cancer Genet Cytogenet，2001，131(2)：125-134.

[10]張嵩，劉曉力，杜慶鋒，等.聯(lián)合應(yīng)用染色體G顯帶和熒光原位雜交技術(shù)檢測急性早幼粒細胞白血病[M].廣東醫(yī)藥，2003，24 (7)：708-710.

[11]劉淑媛，欒樹清，聞芳，等. PML/RARα融合基因不典型FISH信號模式的APL的實驗與臨床特征研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2014，32(4)：374-377.

[12]李承文，劉世和，薄麗津，等.熒光原位雜交技術(shù)在急性早幼粒細胞白血病診斷中的應(yīng)用[J].中華血液學(xué)雜志，2004，25(6)：346-350.

[13]Redner RL．Variations on a theme：the altermate translocation in APL[J]．Leukemia，2002，16(10)：1927-1932.

[14]De Braekeleer M，Lin CC．The occurrence of the 15；17 translocation in acute promyelocytic leukemia [J]．Cancer Genet Cytogenet，1986，19(3-4)：311-319．

[15]陳雷，梅建剛，裘旭華，等.治療相關(guān)性急性早有粒細胞白血病的臨床及實驗室特征[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22(6)：1427-1429.

·論著·

Clinical significance of detecting PML/RARα fusion gene in acute promyelocytic leukemia

LIU Xiaoning，LI Yuanyuan，GAN Yimin，CHEN Fengli，HENG Chun，YU Liang，et al. Central Laboratory，No.1 Hospital of Huai’an，Nanjing Medical University，Huai’an Jiangsu 223300，China.

Abstract：Objective To explore the application value of detecting PML/RARα fusion gene in the diagnosis of acute promyelocytic leukemia(APL) with fluorescence in situ hybridization(FISH). Methods The chromosome karyotype of 28 cases of APL patients was analyzed with the conventional cytogenetic analysis method and the PML/RARα fusion gene was detected with FISH method. Results Among 28 first diagnosed APL patients，the t (15；17)(q22；q12) was detected in 24 25 patients with the conventional karyotype analysis；Two patients were detected to be normal karyotype；And the t (15；17) was not detected in one case. The karyotype analysis results showed the complex abnormalities involving in the chromosome 15 and 17；The PML/RARα fusion gene was detected to exist in all cases with FISH detection. Conclusion The PML/RARα fusion gene detection with FISH method is a reliable way for the diagnosis of APL with fine specificity and sensitivity.

Key words:Acute promyelocytic leukemia；PML/RARα fusion gene；Fluorescence in situ hybridization(FISH)；Chromosome

(收稿日期2014-08-22；修回日期2016-03-15)

作者簡介：劉小寧，女，1969年2月出生，副主任技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，臨床檢驗專業(yè)。研究方向：血液學(xué)基礎(chǔ)實驗診斷。

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金項目，編號：BK20141254。

DOI：10.3969/j.issn.1674－1129.2016.02.004

中圖分類號：R733.71，R446.62

文獻標識碼：A

文章編號：1674－1129(2016)02－0140－03