柳朝陽，陸宏軍，榮光影，張　濤，孫法明

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007)

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移植NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)AD大鼠行為學(xué)的影響①

柳朝陽，陸宏軍，榮光影，張濤，孫法明

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007)

關(guān)鍵詞:NEP基因;神經(jīng)干細(xì)胞; AD大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)病理過程的關(guān)鍵問題是患者腦中β－淀粉樣多肽(Aβ)的異常增加和沉積［1］。中性內(nèi)肽酶(NEP)是腦內(nèi)最重要的Aβ降解酶，是影響腦內(nèi)Aβ分解代謝速率的限制因素［2］。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)是具有向多種細(xì)胞系分化又具有自我更新能力的細(xì)胞［3］。NSCs治療AD是運(yùn)用其特性修復(fù)和替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，另外，NSCs是非常理想的基因載體，擁有許多其他載體所沒有的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植到AD大鼠側(cè)腦室，觀察行為學(xué)的變化，為阿爾茨海默病的治療提供新的依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔SD大鼠由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試劑

胎牛血清、Aβ1－40、神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、神經(jīng)小球分散試劑盒等均購于美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型的建立［4］

選左側(cè)海馬CAI區(qū)為注射區(qū):根據(jù)Pellegrino和Cusmhna的大鼠腦立體定位圖譜，確定本研究中的注射坐標(biāo)為前囪后3.3mm，中線左側(cè)2.2mm，硬腦膜下2.8mm。用微量加樣器緩慢注射Aβ－40溶液1μL，之后緩慢撤針，充分消毒，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，待兩周后做細(xì)胞移植。

1.3.2分組和細(xì)胞移植

30只AD大鼠在隨機(jī)分為3組，每組各10只: AD模型組、移植神經(jīng)干細(xì)胞組(NSCs組)和移植NEP基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞組(NEP－NSCs組)。選左側(cè)海馬CAI區(qū)在3組AD大鼠分別微量植入6μL細(xì)胞培養(yǎng)液、NSC懸液及NEP－NSC懸液(濃度約為1×105個(gè)細(xì)胞/μL)，注射完畢后，全層縫合頭皮，腹腔注射青霉素，術(shù)后放置于溫暖安靜處至清醒。每組大鼠術(shù)后第8周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)［5］

實(shí)驗(yàn)期限為6d。實(shí)驗(yàn)前讓大鼠自由游泳1分。在水迷宮象限的中央固定隱蔽平臺(tái)的位置，將每只大鼠頭朝外壁在任何一個(gè)象限內(nèi)的隨機(jī)位置放入水中，大鼠爬到平臺(tái)上或到達(dá)60秒時(shí)，實(shí)驗(yàn)立即停止。大鼠自己爬到平臺(tái)或操作人員引導(dǎo)使其爬上平臺(tái)后停留10秒。每天訓(xùn)練4次，每次間隔30min。通過影像系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。此實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量動(dòng)物在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.3.4空間探索實(shí)驗(yàn)

第7天在水迷宮中撤除平臺(tái)，將動(dòng)物在任意一個(gè)入水點(diǎn)將放入水中，檢測(cè)60秒時(shí)間內(nèi)，大鼠出現(xiàn)在目標(biāo)象限(target quadrant，TQ)的百分比。此實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)動(dòng)物保持記憶能力。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.3軟件分析，各組間統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以珋±s表示。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)測(cè)試

與AD模型組相比，NEP－NSCs組和NSCs組的AD大鼠在第4、5、6天的平均潛伏期均明顯縮短(P＜0.05)，以NEP－NSCs組尤為明顯，且NEPNSCs組的AD大鼠在第4、5、6天的平均潛伏期亦明顯比NSCs組縮短(P＜0.05)。

表1　各組大鼠在移植術(shù)后第8周的隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)1～6d的平均潛伏期(珋±s，n =10)

表1　各組大鼠在移植術(shù)后第8周的隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)1～6d的平均潛伏期(珋±s，n =10)

注:與AD模型組比較a)P＜0.05;與NSCs組比較b)P＜0.05。

1d　2d　3d　4d　5d　6d AD模型組　32.43±15.72　 28.22±20.71　 28.29±13.91　 26.03±8.91　 22.76±11.75　 17.64±6.02 NSCs組　30.51±13.82　 26.61±17.91　 24.67±10.94　 21.46±5.19a)　17.43±5.69a)　14.15±2.04a)NEP－NSCs組　28.43±12.72　 23.75±14.96　 21.59±1.89　 14.61±3.07a) b)　12.62±3.32a) b)　10.61±1.03a) b)

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)

與AD模型組相比，NSCs組和NEP－NSCs組AD大鼠在目標(biāo)象限探索時(shí)間的百分比有所增加，以NEP－NSCs組明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表2　各組大鼠在探索實(shí)驗(yàn)中在TQ象限中搜索時(shí)間所占百分比(x珋±s，n =8)

3　討論

本實(shí)驗(yàn)中Aβ海馬CAI區(qū)微量注射制備AD大鼠模型，將NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植到AD模型大鼠側(cè)腦室區(qū)，通過隱蔽平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)NEP基因轉(zhuǎn)染對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隱蔽平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)中，與AD模型組相比，NEP－NSCs組和NSCs組在第4、5、6天的平均潛伏期均明顯縮短(P＜0.05) ;與NSCs組相比，NEP－NSCs組第4、5、6天的平均潛伏期亦明顯縮短(P＜0.05)。這表明NEP－NSCs組和NSCs組均能顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。空間探索實(shí)驗(yàn)中，與AD模型組相比，NEPNSCs組和NSCs組在TQ象限搜索時(shí)間的百分比有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，海馬移植了轉(zhuǎn)染NEP基因的神經(jīng)干細(xì)胞后，可以明顯改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，原因是由于海馬移植了轉(zhuǎn)染NEP基因的的神經(jīng)干細(xì)胞后，可以高表達(dá)NEP蛋白，NEP蛋白是Aβ降解酶，因此可以減少Aβ在皮層及海馬區(qū)的沉積，降低了Aβ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。從而改善和提高了AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。

參考文獻(xiàn):

［1］Debora D，Jean－Paul N.Proteomic analysis of cerebrospinal fluid from multiple sclerosis patients［J］.Proteomics，2004，4: 2117－2124

［2］Wasinger V C，Cordwell S J，Cerpa－Poljak A，et al.Progresswith gene－product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma gen－italium ［J］.Electrophoresis，1995，16(7) : 1090－1094

［3］張維燁，李艷君，陳立強(qiáng).神經(jīng)干細(xì)胞分化研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2005，28(3) : 89－90

［4］朱飛奇，馬英，錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ 1－40建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型［J］.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28(2) :106－108

［5］李萍.阿爾茨海默氏病大鼠模型的建立及行為學(xué)評(píng)價(jià)［J］.寧波大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，24(2) : 103－106

(收稿日期:2016－02－02)

通訊作者:張濤(1971～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: ztlzy1971@163.com。

作者簡(jiǎn)介:柳朝陽(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。

基金項(xiàng)目:①1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目，編號(hào): 2009－336; 2.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào): 1252G059 ; 3.黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號(hào): H2015074; 4.佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào): Sz2011－009。

中圖分類號(hào):R285.5; R73－36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1008－0104(2016) 02－0133－01