孫盛洋，郭玉剛

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154003)

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CaMKⅡ在高脂血癥大鼠陰莖海綿體中的表達及其對RAF/MEK含量的影響①

孫盛洋，郭玉剛

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:研究高脂血癥對大鼠陰莖海綿體中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)表達的影響和對RAF激酶/分裂原活化抑制劑(RAF/MEK)含量的影響。方法:32只雄性Wistar大鼠隨機分為實驗組和對照組，在實驗第10天和第20天，隨機各選兩中組一半大鼠觀察勃起情況;采用免疫組化及圖像分析的實驗方法對其海綿體所含CaMKⅡ研究觀察并測所含計量，同時測量P－RAF的表達情況;以分光光度的實驗方法對海綿體勻漿中一氧化氮合酶(NOS)的活性濃度進行量的測量。結果:實驗第10天，實驗組CaMKⅡ表達較對照組低，NOS活性及大鼠陰莖勃起次數(shù)均降低(P＜0.05) ;實驗第20天，實驗組及對照組的CaMKⅡ均降低，P－RAF的表達呈減少趨勢(P＜0.05)，與第10天相比明顯降低(P＜0.05)。結論:高脂血癥大鼠陰莖海綿體CaMKⅡ、P－RAF表達下降，NOS活性降低，高脂血癥是勃起功能障礙誘因。

關鍵詞:高脂血癥; CaMKⅡ; P－RAF;一氧化氮合酶

男性疾病中勃起障礙(ED)較為常見，越來越多的學者研究此疾病的流行及其發(fā)病原理。許多實驗資料及臨床記錄表明高脂血癥引起陰莖勃起障礙，主要是由晚期動脈堵塞所致對內(nèi)皮細胞與平滑肌的作用及對陰莖外周神經(jīng)的控制受到破壞。目前研究表明，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)通過磷酸化而對內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性進行抑制從而使海綿體中平滑肌興奮性降低最終致陰莖勃起障礙，但目前尚未找到其磷酸化的作用點［1］。ERK1/2信號與有關信號共同在在大鼠海綿體平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞內(nèi)作用調(diào)節(jié)陰莖勃起。本實驗研究對Raf/MEK/ERK1/2信號通路于大鼠陰莖的勃起中起到的作用及其各信號之間的聯(lián)系做了記錄，以求探清對陰莖勃起的作用分子［2］。

1　材料和方法

1.1實驗動物

實驗動物挑選種系相同，年齡皆為3個月的雄性大鼠Wistar共計32只，隨機分配分為兩組，一組為實驗組(高脂血癥大鼠)，一組為對照組(正常大鼠)，各為16只。

1.2試驗方法

通過培養(yǎng)實驗模型進行血液檢查、病理檢查。對陰莖勃起的功能進行測定，收集標本和制備陰莖海綿體勻漿，制作切片后觀察組織形態(tài)，用染色法觀察陰莖組織中的CaMKⅡ，并計算灰度值。采用考馬斯亮蘭法檢測組織蛋白的濃度，根據(jù)NOS試劑盒的說明書進行準確操作測定NOS的活性。

1.3統(tǒng)計學方法

試驗數(shù)據(jù)兩兩比較用t校驗，多組比較運用方差分析，直線相關回歸處理相關統(tǒng)計，以均數(shù)±標準差來表示實驗的各項數(shù)據(jù)，當P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1阿樸嗎啡臨床效果

頸部給予注射APO后，觀察大鼠陰莖勃起功能表現(xiàn)，高脂組10d陰莖勃起次數(shù)(2.05±0.68)與對照組10d (3.18±1.34 )相比，顯著減少(P＜0.05) ;高脂組20d(1.14±0.29)陰莖勃起次數(shù)與對照組20d (3.21±1.30)相比，顯著減少(P＜0.05) ;高脂組20d(1.14±0.29)與高脂組10d(2.05±0.68)相比，陰莖勃起次數(shù)明顯降低(P＜0.05)。

2.2 eNOS和NOS蛋白表達

在陰莖海綿體與竇壯隙內(nèi)皮細胞的細胞核和細胞漿中，主要表達eNOS蛋白，黃棕色顆粒表示其為陽性，呈局部性、散在性分布。而在陰莖海綿體平滑肌組織細胞及其間質(zhì)中，主要表達eNOS蛋白，棕褐色為陽性表達標準，表現(xiàn)為彌漫性。各組的eNOS陽性反應，見表1。

1eNOS(±s)

1eNOS(±s)

注:*與對照組比較P＜0.05;△與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　eNOS蛋白吸光度值A實驗組10d觀察組　0.0816±0.0028*20d觀察組　0.0651±0.0062＊△對照組10d觀察組　0.1143±0.0013 20d觀察組0.1063±0.0024

2.3大鼠陰莖組織內(nèi)CaMKⅡ的檢測CaMKⅡ免疫

組織化學染色

CaMKⅡ陽性著色均呈棕黃色顆粒，主要定位于海綿竇和血管內(nèi)皮細胞。圖像分析結果:高脂組與對照組相比，大鼠陰莖海綿體組織細胞胞漿內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值明顯升高(P＜0.05) ;高脂組兩個階段相比，高脂組20d與高脂組10d比較，大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值有顯著性差異(P＜0.05)，說明隨病程延長，CaMKⅡ的表達逐漸增加。

表2　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

表2　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

注:#與對照組比較P＜0.05;▲與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　　平均灰度值對照組10d　102.35±3.17對照組　20d　103.10±2.85高脂組　10d　121.28±3.76#高脂組　20d　140.56±3.95▲

2.4 P－RAF的測定

高脂組大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較對照組明顯增加(P＜0.05) ;高脂組20d大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較高脂組10d增加(P＜0.05)，說明隨病程延長，P－RAF含量逐漸增加。

表3　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中P－RAF含量(±s)

表3　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中P－RAF含量(±s)

注:⊿與對照組比較P＜0.05;▲與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　P－RAF 濃度對照組10d　5.84±0.41對照組　20d　3.55±0.37高脂組　10d　7.08±1.27⊿高脂組　20d　7.42±1.28▲

3　討論

本次研究通過建立患有高脂血癥大鼠的動物模型，推測高脂血癥對于大鼠陰莖內(nèi)的eNOS的作用效果，研究疾病發(fā)生的病理機制。實驗結果顯示，兩組的陰莖勃起頻率明顯降低，eNOS的活性也受到明顯抑制，實驗組與對照組存在明顯差異，證明高脂血癥對大鼠陰莖內(nèi)的eNOS的活性具有抑制作用，繼而造成陰莖勃起功能障礙。此外，實驗組對于六周后與12周后的實驗數(shù)據(jù)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)eNOS的活性均受到明顯抑制，推測此結論為陰莖勃起功能障礙的病理機制［3］。CaMKⅡ免疫組織化學染色結果: CaMKⅡ陽性著色均呈棕黃色顆粒，主要定位于海綿竇和血管內(nèi)皮細胞［4］。圖像分析結果:高脂組與對照組相比，大鼠陰莖海綿體組織細胞胞漿內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值明顯升高(P＜0.05) ;高脂組兩個階段相比，高脂組20d與高脂組10d比較，大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值有顯著性差異(P＜0.05)，說明隨病程延長，CaMKⅡ的表達逐漸增加。高脂組大鼠陰莖海綿體組織中PRAF含量較對照組明顯增加(P＜0.05) ;高脂組20d大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較高脂組10d增加(P＜0.05)，說明隨病程延長，P－RAF含量逐漸增加。CaMKⅡ表達增加，P－RAF含量增加，影響eNOS在大鼠陰莖海綿體中的含量，這可能是高脂血癥引起ED的發(fā)病機制之一［5］。根據(jù)上述報告顯示，通過喂養(yǎng)法建立動物模型并進行觀察研究，結果表明陰莖勃起與高脂血癥具有密切關系［6］。由于國人在飲食以及生活環(huán)境受到很多負面影響，促使高脂血癥及其并發(fā)癥的發(fā)病率逐年升高［7］。本次試驗的研究結果證實高脂血癥對于陰莖勃起功能的影響，高脂血癥大鼠陰莖海綿體CaMKⅡ、P－RAF表達下降，NOS活性降低。高脂血癥是勃起功能障礙的誘發(fā)因素的一種。

參考文獻:

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［2］Bredt DS.Endogenous nitric oxide synthesis : biological functions and pathophysiology［J］.Free Radic Res，1999，31(6) : 577－596

［3］郝鵬，李堅，羅振國，等.高同型半胱氨酸血癥大鼠與勃起功能障礙的相關性研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(1) : 97－98

［4］張?zhí)煊睿艔牧?，遲寶進，等.增齡對大鼠陰莖海綿體內(nèi)CSE及H2S含量變化的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2015，38(4) : 137－140

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［6］孫文娟，劉潔，楊世杰，等.不同產(chǎn)地長梗燕白提取物對高脂血癥大鼠脂代謝的影響及其抗氧化作用［J］.白求恩醫(yī)科大學學報，1999，25(3) : 259－261

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The expression of hyperlipidemia CaMKⅡin rat corpus cavernosum and its impact on RAF/MEK content

SUN Sheng－yang，GUO Yu－gang
(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:Objective: To study the effects of CaMKⅡin rat corpus expression and influence of hyperlipidemia on the RAF / MEK＇s.Methods: 32 male wistar rats were randomly divided into experimental and control groups in the experiment 10 days and 20 days.Rats were randomly selected in each group，and they were observed erections half; measuring the expression of CaMKⅡ，P－RAF＇s; nitric oxide synthase (NOS) activity concentrations.Results: In the first 10 days，the experimental group CaMKⅡexpression compared with the control group，NOS activity and penile erections were lower (P＜0.05) ; experiment first 20 days，the experimental group and the control group CaMKⅡdecreased，P－RAF expression tended to decrease (P＜0.05)，which was significantly lower compared with the first 10 days (P＜0.05).Conclusion: The expression of corpus cavernosum CaMKⅡ，P－RAF for hyperlipidemia rat decreased，and NOS activity is low.Hyperlipidemia is the incentive of erectile dysfunction.

Key words:hyperlipidemia; CaMK ; P－RAF; nirtic oxide synthase

(收稿日期:2015－12－07)

通訊作者:郭玉剛(1967～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E－mail: 15145487111@163.com。

作者簡介:①孫盛洋(1982～)男，黑龍江富錦人，碩士，住院醫(yī)師。

中圖分類號:R691.5

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0061－02