趙　洋，朱曉峰，楊成鵬，張浩業(yè)，鄒志田

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，黑龍江佳木斯154003)

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CXCL12及其受體CXCR7在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)①

趙洋，朱曉峰，楊成鵬，張浩業(yè)，鄒志田

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:探討趨化因子12(C－X－C chemokine ligand 12，CXCL12/SDF－1)及其特異性受體CXCR7在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。方法:運(yùn)用免疫組化法觀察52例NSCLC患者癌組織和癌旁肺組織中CXCL12、CXCR7的表達(dá)情況。結(jié)果: NSCLC標(biāo)本中CXCL12/CXCR7的高表達(dá)率(67.31%、57.69%)顯著高于正常肺組織，CXCL12、CXCR7高表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期聯(lián)系緊密，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CXCL12與CXCR7陽性高表達(dá)率具有一致性(r = 0.57，P＜0.05)。結(jié)論: CXCL12、CXCL7高表達(dá)和NSCLC臨床分期及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者表達(dá)具有相關(guān)性，選擇性阻斷受體CXCR7的作用對控制非小細(xì)胞肺癌發(fā)展可能具有一定的價值。

關(guān)鍵詞:非小細(xì)胞肺癌; CXCL12; CXCL7;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;免疫組化

目前肺癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升，已經(jīng)成為我國死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%以上，雖然現(xiàn)在提倡個體化方案的整體治療，但肺癌病人總5年生存率僅僅約20%，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然是導(dǎo)致死亡的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)［1］，趨化因子及其受體在許多生理、病理，胚胎發(fā)生、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中起著重要作用。CXCR7被認(rèn)定為CXCL12的第二受體，同時肯定CXCR7在CXCL12的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，從而打破了過去認(rèn)為CXCR4是CXCL12唯一受體的觀點，為趨化因子/受體的研究開辟了新的空間。本實驗通過觀察CXCL12、CXCR7蛋白在NSCLC及癌旁肺組織中的表達(dá)情況，探討CXCL12/CXCR7與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，從而指導(dǎo)臨床實踐評估患者預(yù)后情況。

1　材料與方法

1.1材料

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013－10～2015－09 NSCLC患者手術(shù)切除標(biāo)本52例，手術(shù)前未經(jīng)放化療，所有患者中男29例，女23例，年齡42 ～65歲，平均56歲;肺腺癌29例，鱗狀上皮細(xì)胞癌23例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的36例，未見轉(zhuǎn)移的16例; 按WHO肺癌TNM標(biāo)準(zhǔn)分級、分期:低分化21例，中分化19例，高分化12例;Ⅰ期16例，Ⅱ期11例，Ⅲ期25例。取癌旁肺組織(距癌周邊至少5cm)作為對照組。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色SP法，所獲標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，進(jìn)行石蠟包埋后切片，厚度為5μm。常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)(CXCL12行檸檬酸鹽修復(fù)，CXCR7行EDTA修復(fù))，加入3%雙氧水，血清封閉，室溫1h，1: 100兔抗人多克隆抗體，4℃過夜，PBS沖洗，滴加二抗工作液，室溫孵育30min，PBS沖洗;滴加DBA工作液，最后蘇木素復(fù)染2～3min，梯度酒精脫水后置于二甲苯，封片膠封固。

1.2.2染色結(jié)果判斷

判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。陽性細(xì)胞數(shù)與觀察細(xì)胞數(shù)之比值記為細(xì)胞染色陽性率。細(xì)胞染色陽性率小于5% 記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51% ～75%記3分，大于75%記4分。染色結(jié)果:無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項結(jié)果相乘: 0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+ )，3～6分為中度陽性()，大于6分為強(qiáng)陽性()。(－)和(+ )為低表達(dá)，)和()為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，運(yùn)用四格表的χ2和行×列表資料的χ2檢驗分別對兩樣本率和多樣本率進(jìn)行比較。P＜0.05時，為有顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1 CXCL12、CXCR7在NSCLC和癌旁肺組織中的表達(dá)及二者相互關(guān)系

免疫組化分析52個NSCLC組織，CXCL12高表達(dá)35個，高表達(dá)率為67.31% (35/52)，染色呈淡黃色和棕黃色主要集中于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。CXCL12在癌旁肺標(biāo)本中高表達(dá)率僅38.46% (20/52)，余正常肺標(biāo)本均呈低表達(dá)(圖2)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 8.68，P＜0.01)。

圖1　NSCLC組織中CXCL12高表達(dá)(×400)

圖2　癌旁肺組織中CXCL12低表達(dá)(×400)

圖3　NSCLC組織中CXCR7高表達(dá)(×400)

CXCR7在52個NSCLC標(biāo)本中皆出現(xiàn)不同程度染色，高表達(dá)率是57.69% (30/52)，棕黃色和棕褐色染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖3)。在對照組癌旁肺組織中CXCR7大部分呈低表達(dá)(圖4)，高表達(dá)率僅為26.92%(14/52)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 10.09，P＜0.01)。

圖4　癌旁肺組織中CXCR7低表達(dá)(×400)

NSCLC組織中CXCL12與CXCR7高表達(dá)呈現(xiàn)一致性(r = 0.57，P＜0.05 )。見表1。

表1　NSCLC組織中CXCL12與CXCR7高表達(dá)的相關(guān)性

2.2 CXCL12、CXCR7在NSCLC中的表達(dá)情況與臨

床病理特征的關(guān)系

在NSCLC中CXCL12、CXCR7高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期關(guān)系密切(P＜0.05)，隨著TNM的分期增高，CXCL12、CXCR7蛋白表達(dá)水平也升高，Ⅱ、Ⅲ期明顯高于Ⅰ期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CXCL12、CXCR7高表達(dá)率和NSCLC病人的性別、年齡大小、組織學(xué)分型、分化程度等無關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表2　CXCL12、CXCR7的蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

趨化因子是具有趨化作用的一類小分子多肽，能趨化免疫細(xì)胞定向移動參與機(jī)體的調(diào)節(jié)反應(yīng)。趨化因子與其受體特異性結(jié)合，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與肝癌、乳腺癌、鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤、胰腺癌等密切相關(guān)［2，3］。最新研究［4］發(fā)現(xiàn)一種新的受體CXCR7，打破了過去認(rèn)為CXCR4是CXCL12唯一受體的觀點。CXCR7是RDC1編碼七次跨膜受體，也可與CXCL12相結(jié)合，在正常細(xì)胞不表達(dá)或僅微弱表達(dá)，但是在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)明顯上調(diào)，提示CXCR7高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的遷移、血管的新生密切相關(guān)。

Yamada K等［5］實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中通過ERK1/2的磷酸化反應(yīng)使CXCR7的表達(dá)水平明顯上升，從而促進(jìn)腫瘤的血管生成，同時ELISA實驗表明在正常細(xì)胞中CXCR7受體未見明顯表達(dá)。Monnier J等［6］實驗研究表明多種類型的腫瘤組織如肺癌、腎癌、前列腺癌、食管癌、子宮頸癌等與正常組織相比較，CXCR7的表達(dá)顯著上調(diào)。本組實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，結(jié)果統(tǒng)計顯示，在NSCLC標(biāo)本中CXCR7、CXCL12的高表達(dá)率是57.69%、67.31%，均高于正常肺組織(26.92%、38.46%)，且兩者成正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05 )，表明CXCR7、CXCL12高表達(dá)和NSCLC的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系緊密。

乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)［7］，CXCR7、CXCL12的高表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中明顯增高，表明CXCR7、CXCL12是促進(jìn)乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。本組實驗顯示，CXCR7、CXCL12蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的高表達(dá)率是69.44%、77.78%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者是31.25%、43.75%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CXCR7、CXCL12高表達(dá)和患者年齡、性別、組織學(xué)分型、分化程度無關(guān)，和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本組實驗還發(fā)現(xiàn)CXCR7、CXCL12高表達(dá)率也和非小細(xì)胞肺癌的臨床分期關(guān)系緊密，隨著TNM的分期增高，CXCR7、CXCL12蛋白表達(dá)水平也升高，Ⅱ、Ⅲ期明顯高于Ⅰ期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其作用機(jī)制可能是CXCR7與CXCL12結(jié)合形成異源二聚體，從而促進(jìn)CXCL12介導(dǎo)的、依賴β－抑制蛋白－2通路的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括P38MAPK、EPK1/2、SAPK路徑，調(diào)控刺激腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移［8］。Yu Y等［9］應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)來抑制卵巢癌中CXCR7蛋白表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中CXCR7表達(dá)明顯減少，腫瘤生長明顯減緩，進(jìn)一步表明CXCL12/CXCR7在癌細(xì)胞黏附及遷移中起到關(guān)鍵作用。

本實驗結(jié)果提示CXCL12/CXCR7高表達(dá)可能與NSCLC的惡性行為密切相關(guān)，在Wang L等［10］研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR7陽性患者與陰性患者比較，5年生存率明顯降低，CXCR7高表達(dá)預(yù)示生存時間縮短，提示CXCR7作為獨立的預(yù)后因素，有望成為評估NSCLC進(jìn)展及預(yù)后的重要指標(biāo)。同時針對CXCL12/CXCR7生物靶點的干擾治療將為腫瘤的治療開辟新途徑。

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(收稿日期:2015－11－30)

通訊作者:鄒志田(1962～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: zxf700105@ sina.com。

作者簡介:趙洋(1990～)男，山東威海人，在讀碩士研究生。

基金項目:①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號: LM2015_040。

中圖分類號:R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0044－03