劉東璞，盧鳳美，盛延良，孟慶媛，張　輝

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江佳木斯154007)

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紅景天對(duì)大鼠肝纖維化肝臟中HAb18G/CD147的表達(dá)①

劉東璞，盧鳳美，盛延良，孟慶媛，張輝

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:探討紅景天對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織中HAb18G/CD147基因表達(dá)的影響。方法:健康♂SD大鼠60只隨機(jī)分組: (1)對(duì)照組(20只)，腹腔給予橄欖油和生理鹽水ig; (2)模型組(20只)，以CCl4ip法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化; (3)干預(yù)組(20只)，在造模的同時(shí)給予紅景天ig。8 wk實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，留取部分肝臟組織做HE，部分應(yīng)用半定量RT－PCR檢測(cè)HAb18G/CD147mRNA的表達(dá)情況，部分用免疫組化檢測(cè)肝組織中HAb18G/CD147的表達(dá)。結(jié)果:干預(yù)組大鼠肝組織中HAb18G/CD147mRNA及蛋白陽性表達(dá)陽性率明顯均低于模型組(P＜0.05) ;肝組織HAb18G/CD147蛋白表達(dá)與HAb18G/CD147mRNA水平變化成正相關(guān)。結(jié)論:中藥紅景天能有效抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中HAb18G/CD147表達(dá)。

關(guān)鍵詞:紅景天;肝纖維化; HAb18G/CD147

肝纖維化是各種肝臟慢性疾病向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［1］，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)肝纖維化階段是可逆的病理變化，因此在肝臟慢性疾病過程中控制肝纖維化進(jìn)展可有效防止肝硬化的發(fā)生，具有極為重要的臨床意義。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥紅景天可以保護(hù)肝細(xì)胞，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而抑制肝纖維化的發(fā)展。HAb18G/CD147又稱EMMPRIN(細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子)，屬于免疫超家族成員，是一種分子量43－66 kDa的跨膜糖蛋白，在多種起源于上皮組織的腫瘤以及炎癥組織中表達(dá)。其作用機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP－1、MMP－2、MMP－9)使細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［2］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組織中在竇周間隙HAb18G/CD147高表達(dá)，這提示HAb18G/CD147在肝纖維化發(fā)展過程中具有重要作用［3］。本文應(yīng)用半定量RT－PCR技術(shù)及免疫組化技術(shù)，以HAb18G/CD147為靶基因，檢測(cè)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型中HAb18G/CD147的表達(dá)，同時(shí)觀察紅景天對(duì)肝纖維化模型中HAb18G/CD147表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討紅景天干預(yù)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的可能分子機(jī)制及治療肝纖維化的最佳藥物濃度。

1　材料和方法

1.1材料

健康♂SD大鼠60只，體重180～220g，購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。紅景天膠囊購自廣東長興科技尊然健康管理有限公司。四氯化碳(CCl4)購自鄭州宇騰化工廠。HAb18G/CD147上下游引物、兔抗鼠一抗、組織RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的免疫組化通用型羊抗兔的二抗工作液購于上海穎心實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1分組:健康SD♂大鼠60只，隨機(jī)分組(各組間暴露因素?zé)o差別，P＞0.05)。(1)對(duì)照組(20 只) :腹腔給予橄欖油和生理鹽水灌胃; (2)模型組(20只) :以CCl4ip法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，(橄欖油稀釋100mL/L CCl4，每周1次1mL/kg，共8wk) ; (3)干預(yù)組(20只) :同模型組，同時(shí)給予濃度40g/L紅景天(劑量10mL/kg) 2次/W灌胃(共8wk)。在實(shí)驗(yàn)第8周注射CCl4后48h處死，提取大鼠肝臟，部分組織用10%福爾馬林固定，其余肝組織置－80℃冰箱凍存。(試驗(yàn)中所有試劑CCl4及紅景天的最佳劑量均在前期試驗(yàn)中探索出)。

1.2.2常規(guī)HE病理學(xué)檢查。

1.2.3肝組織中HAb18G/CD147mRNA RT－PCR檢測(cè):凍存肝組織TRIzol一步法PCR反應(yīng)。置于凝膠分析系統(tǒng)中進(jìn)行電泳條帶的分析。HAb18G/ CD147:上游: 5＇－ACTCCTCACCTGCTCCTTGA－3＇，下游:5＇－GCCTCCATGTTCAGGTTCTC－3＇，長度528bp;同時(shí)擴(kuò)增GAPDH基因作為內(nèi)參，每一個(gè)反應(yīng)設(shè)置3復(fù)孔。GAPDH:上游: 5＇－GCACCGTCAAGGTCAAGAAC－3＇，下游: 5＇－TGGTGAAGACGAGACTGGA －3＇長度500bp。采用25μl的反應(yīng)體系反應(yīng)條件是: 95℃3min; 95℃30s，57℃30s，72℃30s，39個(gè)循環(huán); 72℃10min; PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用Bio－RadGel Doc2000型凝膠成像系統(tǒng)照像并用Quangtity-One軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)值。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)HAb18G/CD147:用二步法檢測(cè)肝組織中HAb18G/CD147。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1肝纖維化分期

本單位資深臨床病理主任醫(yī)師閱片。模型組20只大鼠均形成明顯肝纖維化(15只為3期以上，1只為早期肝硬化，其余纖維化程度均超過2期)，干預(yù)組大鼠肝組織纖維化程度均較模型組明顯減輕。

2.2 HAb18G/CD147表達(dá)情況

模型組與對(duì)照組比較HAb18G/CD147mRNA的表達(dá)顯著增高(P＜0.05) ;干預(yù)組HAb18G/ CD147mRNA的表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.05，表1，圖1)。HAb18G/CD147在正常肝組織中可見微弱表達(dá)，主要見于竇周間隙中。模型組中HAb18G/CD147的表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為胞漿著色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。紅景天干預(yù)組HAb18G/CD147的表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1，圖2)。

圖2　肝組織中HAb18G/CD147表達(dá)A對(duì)照組B模型組C干預(yù)組

表1　肝組織HAb18G/CD147表達(dá)的變化(±s，n =20)

表1　肝組織HAb18G/CD147表達(dá)的變化(±s，n =20)

aP＜0.05 vs模型組

分組HAb18G/CD147　 HAb18G/CD147mRNA正常組　0.212±0.057a　0.498±0.057a模型組　0.546±0.049　0.861±0.049干預(yù)組　0.321±0.029a　0.598±0.029a

1 Marker 2對(duì)照組3模型組4～6干預(yù)組圖1　肝組織中HAb18G/CD147 mRNA表達(dá)的變化

3　討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化的重要環(huán)節(jié)。肝臟長期受多種損傷因素刺激，使肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化，使肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度增生與沉積，致肝臟組織結(jié)構(gòu)或(和)功能異常。HAb18G/CD147于1982年被發(fā)現(xiàn)，屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。促進(jìn)MMP－3、MMP－9的分泌誘導(dǎo)肝纖維化。研究顯示在角膜成纖維細(xì)胞中HAb18G/CD147通過促進(jìn)α－SMA表達(dá)有效促進(jìn)角膜組織結(jié)構(gòu)的重建與創(chuàng)傷修復(fù)。HAb18G/CD147誘導(dǎo)MMPs產(chǎn)生的MMP－3、MMP－9活化TGF－β，因此推斷HAb18G/CD147、MMP－3、MMP－9和TGF－β1之間呈正反饋效應(yīng)［4～6］。另外，發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147在乳腺癌中可以活化成纖維細(xì)胞，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)行上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化，激活了腫瘤和基質(zhì)的相互作用［7，8］。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)紅景天具有保護(hù)肝細(xì)胞及有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能，具有抑制四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展的良好作用［9，10］。有較多紅景天抑制肝纖維化的報(bào)道，紅景天對(duì)肝纖維化組織內(nèi)相關(guān)成分表達(dá)的影響也有各案報(bào)道［11～13］。紅景天抑制肝癌的報(bào)道，紅景天對(duì)肝癌組織內(nèi)相關(guān)成分表達(dá)的影響也有各案報(bào)道［14］。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色與半定量RT－PCR的方法觀察紅景天對(duì)纖維化肝組織中HAb18G/CD147表達(dá)的影響，大鼠肝組織HAb18G/CD147的表達(dá)減少，明顯低于模型組，高于對(duì)照組，結(jié)果顯示紅景天可以較好防治CCl4損傷性肝纖維化。證實(shí)了紅景天具有通過抑制HAb18G/CD147的表達(dá)保護(hù)HSC及其周圍正常的基底膜樣細(xì)胞，抑制HSC的活化與肝纖維化的發(fā)展。在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中HAb18G/CD147的表達(dá)水平增加，在紅景天干預(yù)過程中HAb18G/CD147的表達(dá)下降，提示HAb18G/CD147與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，紅景天可有效抑制肝纖維化。

目前對(duì)紅景天治療肝纖維化的作用機(jī)制尚未不清楚，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明。尤其是肝纖維化形成過程，紅景天對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞、HAb18G/ CD147表達(dá)的影響機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅景天的臨床抗肝纖維化的藥用價(jià)值提供可靠的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。在今后的臨床工作中，可通過目標(biāo)基因?qū)Ω卫w維化的發(fā)展過程、肝纖維化程度以及治療效果進(jìn)行有效評(píng)估［15，16］。為臨床抗肝纖維化，阻斷肝纖維化的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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(收稿日期:2015－12－17)

通訊作者:盧鳳美(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。E－mail: liudongpu1220@163.com。

作者簡介:劉東璞(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。

基金項(xiàng)目:①1.佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào): S2014－001; 2.佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào): S2013－036。

中圖分類號(hào):R575

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1008－0104(2016) 02－0037－02