丁蘭蘭，王顯鶴，劉喜鳳，楊占雙，吳祥紅，王　嬌，聶　影

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

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奧拉西坦對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后RGMa的表達(dá)①

丁蘭蘭1，王顯鶴2，劉喜鳳1，楊占雙2，吳祥紅2，王嬌2，聶影2

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic－－ischemic brain damage，HIBD)模型，檢測(cè)HIBD大鼠腦組織中排斥導(dǎo)向因子A(RGMa)的表達(dá)變化，探討奧拉西坦對(duì)HIBD大鼠RGMa表達(dá)的影及其對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)及保護(hù)作用。方法:將135只新生7d齡Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組，45只)，缺氧缺血組(HIBD組，45只)和奧拉西坦治療組(45 只)，每組分為12h、24h、48h、72h、7d五個(gè)亞組。sham組只做左側(cè)頸總動(dòng)脈分離，不做缺氧處理，HIBD組及奧拉西坦組做左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎及缺氧處理，分別于術(shù)后腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，分別于術(shù)后12h、24 h、48 h、72 h、7d斷頸處死大鼠。免疫組化檢測(cè)皮質(zhì)及海馬中RGMa表達(dá)。結(jié)果: sham組，可見RGMa有微量表達(dá)，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; HIBD組: RGMa陽性細(xì)胞在造模12h開始表達(dá)，24h升高，48h達(dá)高峰，此后逐漸降低，與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，奧拉西坦治療組各時(shí)間點(diǎn)RGMa表達(dá)均低HIBD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細(xì)胞數(shù)均多于sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: HIBD時(shí)腦組織中RGMa表達(dá)增多，參與腦損傷，奧拉西坦能通過抑制RGMa大量表達(dá)從而促進(jìn)受損神經(jīng)的再生與修復(fù)。

關(guān)鍵詞:缺氧缺血性腦損傷;奧拉西坦; RGMa

HIBD是新生兒窒息后產(chǎn)生的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，迄今仍是導(dǎo)致新生兒死亡和永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的原因。HIBD后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后神經(jīng)元再生困難，主要是因?yàn)檩S突生長(zhǎng)抑制因子妨礙了受損神經(jīng)的的再生，RGMa(Repulsive guidance molecule )是一種新的具有排斥及誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐塌陷的軸突再生抑制蛋白。本課題是利用新生大鼠HIBD模型來探奧拉西坦對(duì)RGMa的影響及其對(duì)神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1材料

清潔級(jí)7d齡Wistar新生大鼠，體重(12.5± 3) g，雌雄不限，均由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，奧拉西坦注射液購(gòu)自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，RGMa購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司，免疫組化試劑盒，DAB顯示劑購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;混合氣體(氮?dú)? 920mL/L，氧氣: 80mL/L) :佳木斯市金鼎氧氣。

1.2分組與造模

將135只新生7d齡Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分3組，假手術(shù)組(sham組)，缺氧缺血組(HIBD 組)，奧拉西坦治療組，每組45只，每組再分為12h、24h、48h、72h、7d六個(gè)亞組。Sham組只做左側(cè)頸總動(dòng)脈分離，不做結(jié)扎。HIBD組和奧拉西坦組參照Rice法建立HIBD模型，新生鼠乙醚吸入麻醉，仰臥膠布固定于手術(shù)板上，常規(guī)酒精消毒。于頸部正中縱行切口，用玻璃分針鈍性分離皮下組織和肌肉，游離并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈后，用4－0號(hào)線結(jié)扎，縫合切口，碘伏消毒局部皮膚后，返回母鼠身邊恢復(fù)1h后，置于自制37°恒溫缺氧倉(cāng)內(nèi)，以2L/min的速度輸入含92%氮?dú)夂?%氧氣的混合氣體，持續(xù)2h。HIBD組和奧拉西坦組分別于術(shù)后10min腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，之后每日一次，分別與12h、24h、48h、72h、7d斷頸處死。

1.3取材

三組均與造模后12h、24h、48h、72h、7d各處死9只大鼠，心臟灌注后斷頭取全腦，并立即將腦組織保存于4%的多聚甲醛0.1mol/L PBS的(pH 7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠腦從視交叉后2～6mm處做腦組織的冠狀切面，取其腦組織脫水石蠟包埋。用石蠟切片機(jī)將蠟塊連續(xù)切片，片厚約3μm，每5張取一張片作免疫組織化學(xué)，取部分做HE染色。

1.4腦組織病理形態(tài)

HE染色法觀察新生大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織形態(tài)變化。

1.5 RGMa免疫組化染色

各組各時(shí)間點(diǎn)的腦組織切片分別用兔抗RGMa抗體作為一抗，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，以PBS代替一抗作為對(duì)照。RGMa陽性為胞質(zhì)染成淺黃色、棕黃色或者棕褐色.采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每張切片分別隨機(jī)選取海馬及皮質(zhì)6個(gè)不重疊視野(×400)，在同一光強(qiáng)度下，計(jì)數(shù)RGMa陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)百分比，取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS.17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)各組的數(shù)據(jù)給予正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)均數(shù)，進(jìn)行單因素方差，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉眼觀察大鼠腦組織形態(tài)

sham組大鼠腦組織形態(tài)正常，HIBD組隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，可見左側(cè)大腦出現(xiàn)水腫、壞死病灶，結(jié)扎側(cè)的腦半球形態(tài)發(fā)生改變。而奧拉西坦治療組腦組織水腫程度較HIBD組輕，未見液化壞死灶。

2.2腦組織病理變化

sham組腦組織各部位形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞層次清楚，形態(tài)正常。HIBD組隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，依次出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、神經(jīng)元排列紊亂、細(xì)胞核固縮、碎裂及壞死灶周圍炎性細(xì)胞增多。奧拉西坦治療組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞腫脹及核固縮、碎裂溶解的細(xì)胞數(shù)均少于HIBD組。

2.3 RGMa表達(dá)

在sham組可見少量RGMa陽性細(xì)胞; HIBD組RGMa陽性細(xì)胞數(shù)于造模12h后可見棕黃色陽性表達(dá)，24h表達(dá)升高，至48h達(dá)高峰，之后維持高濃度，較前逐漸下降。奧拉西坦治療組RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)部位及變化規(guī)律與HIBD組相似，陽性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均低于HIBD組，與HIBD組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與sham組比較，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細(xì)胞數(shù)均多于sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1　各組不同時(shí)間點(diǎn)RGMa陽性細(xì)胞數(shù)(%)比較(±s，n =9)

表1　各組不同時(shí)間點(diǎn)RGMa陽性細(xì)胞數(shù)(%)比較(±s，n =9)

注:與sham組比較，aP＜0.05，b與HIBD組比較P＜0.05。

組別12h　24h　48h　72h　7d sham組　6.00±2.57　6.17±2.38　6.73±2.88　6.59±2.41　6.96±2.43 HIBD組　26.47±2.90a　32.28±5.91a　58.59±6.51a　51.30±5.94a　40.40±5.45a奧拉西坦組　22.28±3.00ab　27.74±5.63ab　52.42±6.40ab　40.76±5.80ab　28.44±3.32abF值　265.67　145.49　473.14　394.34　332.48 P ＜0.05　?。?.05　?。?.05　?。?.05　　＜0.05

圖1　sham組、HIBD組、奧拉西坦治療組大鼠大腦皮質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)RGMa表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×200)

3　討論

HIBD是由多種原因引起的腦缺氧和(或)腦缺血性損傷，可引起新生兒圍生期腦損傷和長(zhǎng)期神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重后遺癥，其后遺癥的發(fā)生與神經(jīng)再生障礙關(guān)系密切。CNS損傷后神經(jīng)再生修復(fù)能力，不僅與神經(jīng)元自身的再生能力有關(guān)，還受神經(jīng)元所處的生存環(huán)境中的各種外源性的生長(zhǎng)促進(jìn)因子和抑制性因子的共同影響。近年來研究比較多的RGMa蛋白，是一種排斥性軸突導(dǎo)向分子，可存在于脈絡(luò)叢、成熟髓磷脂和正形成的瘢痕等干擾軸突生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)中，通過與其受體Neogenin結(jié)合，激活RhoA－Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使神經(jīng)元軸索內(nèi)細(xì)胞骨架重排、生長(zhǎng)錐塌陷，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、再生“流產(chǎn)”［1］。在本研究中，我們以新生7d齡Wistar大鼠為對(duì)象建立HIBD模型，觀察當(dāng)發(fā)生缺氧缺血性腦損傷時(shí)RGMa的表達(dá)變化來評(píng)估軸突損傷及再生情況。在sham組，在新生大鼠的海馬區(qū)、大腦皮層的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞可見RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)，表明RGMa存在于正常的腦組織中，并且可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)控。HIBD組，12h可見RGMa陽性細(xì)胞表達(dá)，24h升高，于48h達(dá)高峰，之后維持高濃度，并較前逐漸降低。由此推測(cè)RGMa在腦損傷急性期表達(dá)增加，抑制軸突再生，并且當(dāng)RGMa達(dá)峰值時(shí)，其對(duì)軸突再生的抑制最大，隨著RGMa的降低，其對(duì)軸突的抑制作用逐漸降低。奧拉西坦可以選擇性的作用于大腦皮層和海馬，能夠改善腦水腫，保護(hù)受損細(xì)胞，激活和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，是一種新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)益智藥。張洋［2］等通過實(shí)驗(yàn)證明奧拉西坦可以改善新生大鼠HIBD模型腦水腫。多項(xiàng)臨床實(shí)踐［3～5］證明奧拉西坦在治療腦卒中，老年癡呆，腦梗死等取得了很好的治療效果。有研究［6］將奧拉西坦應(yīng)用于新生兒缺氧缺血性腦病，取得了良好的治療效果。國(guó)外學(xué)者［7］通過研究表明，在大鼠脊髓損傷模型中，使用RGMa特異性抗體后，結(jié)果表明RGMa抗體能夠綜合RGM，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。Feng J等［8］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中RGMa蛋白在缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬升高，通過給予RGMa特異性RNAi后可顯著促進(jìn)軸突再生，改善大鼠的神經(jīng)功能。近年來多項(xiàng)研究［9～12］表明，通過給予藥物干預(yù)，可促使RGMa表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明奧拉西坦治療組無論在肉眼觀察大鼠的腦體形態(tài)，還是HE染色結(jié)果均顯示，應(yīng)用奧拉西坦后腦組織的損傷程度均低于HIBD組;免疫組化結(jié)果顯示奧拉西坦組RGMa陽性細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于HIBD組，提示給予奧拉西坦后可能抑制RGMa的表達(dá)。目前未見有關(guān)奧拉西坦在HIBD中對(duì)RGMa的影響的報(bào)道。綜上所述，在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的試驗(yàn)中，奧拉西坦可能通過下調(diào)RGMa的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生和修復(fù)。但是奧拉西坦下調(diào)RGMa的機(jī)制目前尚不清楚，這需要我們今后進(jìn)一步探索。

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(收稿日期:2015－12－18)

通訊作者:王顯鶴(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: 312037443@ qq.com。

作者簡(jiǎn)介:丁蘭蘭(1990～)女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士研究生。

基金項(xiàng)目:①1.佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào): LM2015_024 ; 2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)校級(jí)面上項(xiàng)目，編號(hào): S2014－008。

中圖分類號(hào):R743

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1008－0104(2016) 02－0018－03