蔡守平,何學(xué)友，曾麗瓊，蘇文晶，黃金水

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012；

2. 泉州市森林病蟲防治檢疫站，福建 泉州 362000)

?

綠僵菌在木麻黃林間宿存動態(tài)的初步研究

蔡守平1,何學(xué)友1，曾麗瓊1，蘇文晶2，黃金水1

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室，福建 福州 350012；

2. 泉州市森林病蟲防治檢疫站，福建 泉州 362000)

摘要通過測定木麻黃林間土壤中、菌條上的綠僵菌孢子的宿存數(shù)量及萌發(fā)率，研究綠僵菌在木麻黃林中的宿存動態(tài)。結(jié)果表明：綠僵菌孢子引入木麻黃林間土壤中，45 d內(nèi)孢子數(shù)量迅速下降；45 d時土壤中的綠僵菌孢子數(shù)不足初始帶菌量的30%，其后孢子數(shù)量呈持續(xù)緩慢下降或維持在一個相對穩(wěn)定的水平。綠僵菌菌條綁縛在木麻黃樹干上后，其上的孢子迅速下降，至30 d時，菌條孢子量僅為初始值的30%左右，隨后呈現(xiàn)持續(xù)緩慢下降的趨勢。土壤中的孢子萌發(fā)率可始終保持在一個較高水平，而菌條上孢子的萌發(fā)率變化較為復(fù)雜。

關(guān)鍵詞孢子；菌條；萌發(fā)率；綠僵菌；宿存

木麻黃林是我國東南沿海沙地防護(hù)林的主要組成部分，在抵御風(fēng)沙危害、改善生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮了突出作用。但由于沿海生態(tài)條件較為惡劣、造林種質(zhì)資源良莠不齊等因素，木麻黃害蟲時有發(fā)生，影響了木麻黃林的防護(hù)效益[1，2]。筆者所在的課題組在利用綠僵菌等蟲生真菌生物防治木麻黃林主要害蟲方面取得了一些進(jìn)展[3-7]。綠僵菌不僅可以在昆蟲體上營寄生生活，還能在土壤中兼性腐生，保持自身的存活狀態(tài)，在森林生態(tài)系統(tǒng)中維持種群數(shù)量，從而起到持續(xù)防控害蟲的作用[8]。因此，研究綠僵菌在生態(tài)系中的宿存情況，可為更好地利用其持續(xù)、有效地控制害蟲提供理論依據(jù)。近年一些研究分析了綠僵菌在土壤中宿存數(shù)量的動態(tài)變化[9-13]。本文通過對土壤中、菌條上的綠僵菌孢子在木麻黃林間的宿存數(shù)量及萌發(fā)率變化的研究，以期揭示綠僵菌在木麻黃林生態(tài)系統(tǒng)中的宿存情況。

1材料與方法

1.1供試菌劑

供試菌劑生產(chǎn)菌株均為金龜子綠僵菌MetarhiziumanisopliaeMaZPTR-01，為福建省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所分離、保存。

綠僵菌孢子粉制作：綠僵菌孢子粉由福建省林科院森保所實驗室生產(chǎn)，生產(chǎn)方法為液-固雙相發(fā)酵法，綠僵菌菌株經(jīng)液體發(fā)酵后，接種于麥麩、米粉、玉米粉和谷殼(體積比為1∶1∶1∶3)組成的固體培養(yǎng)基中，接種量為15%(V/W)，然后置于淺盤中進(jìn)行固體發(fā)酵，培養(yǎng)室溫度控制在25±2 ℃，濕度90%以上，產(chǎn)孢后經(jīng)自然風(fēng)干，用振動篩(200目)進(jìn)行篩分，得到孢子粉，置于4 ℃保存?zhèn)溆?，?jīng)測定，孢子粉含量為400億孢子g-1。

綠僵菌菌條制作：制作方法參見徐金柱等[14]方法。綠僵菌菌株經(jīng)液體發(fā)酵后，接種于培養(yǎng)載體(市售土工布裁剪的布條)上，布條規(guī)格為40 cm×5 cm。菌條產(chǎn)孢完經(jīng)干燥后，置于4 ℃低溫條件下保存。經(jīng)測定，綠僵菌菌條含孢量為4.4×108孢子cm-2，孢子萌發(fā)率>99%。

1.2試驗地概況

試驗點在福建省惠安赤湖國有防護(hù)林場大山頭工區(qū)，該工區(qū)位于24°54′ N，118°54′ E，海拔15 m，年均降水量為1 033 mm，年均氣溫19.8 ℃。主要林分為木麻黃純林，有少量木麻黃與桉樹(Eucalyptusspp.)、相思樹(Acaciaspp.)等混交林，林齡在30 a以上，郁閉度大于0.8。

1.3綠僵菌在木麻黃林間的宿存動態(tài)

1.3.1綠僵菌孢子在林間土壤中的宿存2015年5月底，從上述試驗地林間取沙土，帶回實驗室過篩，去除樹根、草根、大石子等雜物，取少量孢子粉與篩過的沙土均勻混合。經(jīng)測定，最終土壤帶菌量約為5×107孢子g-1。然后將混合好的帶菌沙土回填入林間準(zhǔn)備好的帶孔塑料框中，使框中土面與地表齊平，并輕輕覆蓋木麻黃枯枝等地被物(作為1個取樣點)。取樣：分別于施菌后15、30、45、60、90、120、150、180、210 d進(jìn)行取樣，取樣時輕輕撥開塑料框上的地被物，用土壤取樣器在每一個點垂直打孔取樣(打孔深度30 cm)，將每個取樣點的3個樣點的土樣混勻，帶回實驗室測定含孢量與孢子萌發(fā)率。共設(shè)置3個取樣小區(qū)，每個小區(qū)間隔100 m以上，每個小區(qū)設(shè)置3個取樣點(3個重復(fù))。

孢子量測定(參考何學(xué)友等研究方法[15])：土樣取回后，加入適量滅過菌的0.05%吐溫80溶液，用高速振蕩器使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，然后在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，換算成含孢量。

孢子萌發(fā)率測定：將上述孢子懸浮液，滴在涂有SDAY培養(yǎng)基的載玻片上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，20 h后，用3%的甲醛溶液固定，顯微鏡下統(tǒng)計發(fā)芽率，每樣5次重復(fù)，以發(fā)芽率計為活孢率。

1.3.2菌條上孢子在樹干上的宿存將上述制作好的綠僵菌菌條輕輕綁縛于木麻黃樹干基部50 cm處一圈，菌條用多根鐵釘固定。定期(與土壤取樣時間一致)隨機剪取寬度為1～2 cm的小方塊，設(shè)置3個取樣點，每個取樣點每次取3個菌條小塊，帶回實驗室后放入燒杯內(nèi)，加入一定量的0.05%吐溫80溶液，高速振蕩器充分振蕩使孢子分散。然后用血球計數(shù)板計數(shù)，最后換算成單位面積的孢子含量。

孢子萌發(fā)率測定同1.3.1。

2結(jié)果與分析

2.1綠僵菌孢子在木麻黃林土壤中的宿存

綠僵菌孢子引入木麻黃林間土壤后其孢子數(shù)量宿存情況見圖1。從圖1中可以看出，在最初的45 d內(nèi)孢子數(shù)量快速下降，隨后持續(xù)緩慢下降或維持或下降到一定程度后恢復(fù)。施菌45 d后，土壤中的綠僵菌孢子數(shù)為1.32×107孢子g-1，不足初始帶菌量的30%(4.85×107孢子g-1)，而后孢子數(shù)量下降速度減緩，至210 d時，土壤中孢子數(shù)量維持在0.64×107孢子g-1。

綠僵菌孢子在木麻黃林土壤宿存過程中萌發(fā)率變化見圖2。從圖2中可以看出，試驗期間土壤中綠僵菌孢子萌發(fā)率總體維持在較高的水平，除210 d時孢子萌發(fā)率為91.5%，顯著低于其他時間的孢子萌發(fā)率以外，其他時間孢子萌發(fā)率基本維持在95%以上，可見土壤中宿存的孢子活力維持較好。

2.2綠僵菌菌條上孢子在木麻黃林中的宿存

綠僵菌菌條綁縛在木麻黃樹干上后，其上的孢子量變化情況見圖3。從圖3中可以看出，菌條綁縛在樹干上后，其上的孢子迅速下降，15 d時菌條上的孢子量為初始值的1/2左右，至30 d時，菌條上平均1.51×108孢子cm-2，僅為初始值的30%左右。45 d時孢子量少量回升，之后呈緩慢下降的趨勢，至210 d時，菌條上的孢子量平均僅為0.4×108孢子cm-2，不足初始值的1/10，菌條表面基本看不到孢子的存在，僅在靠樹干面的菌條還有少量孢子可見。

菌條上孢子萌發(fā)率情況見圖4。從圖4中可以看出，菌條上的孢子萌發(fā)率變化較土壤中復(fù)雜，萌發(fā)率整體呈逐漸下降的趨勢，不同時間菌條上孢子萌發(fā)率差異顯著，至180 d和210 d時，菌條上孢子萌發(fā)率低于90%，而其他時間段孢子萌發(fā)率基本維持在90%以上。

3結(jié)論與討論

木麻黃是東南沿海防護(hù)林的主要造林樹種，但沿海地區(qū)環(huán)境特殊，土壤主要是以沙土為主，且沿海地區(qū)風(fēng)大，綠僵菌在木麻黃林中的宿存能力對木麻黃主要害蟲的持續(xù)控制作用具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌孢子引入木麻黃林土壤中，45 d內(nèi)綠僵菌孢子量迅速下降，其后進(jìn)入一個平穩(wěn)期，甚至在某些時間段，孢子量還有少量回升，說明綠僵菌孢子在土壤中成功定殖，并維持在一個相對穩(wěn)定的水平，這對保持林間的帶菌量具有重要作用。其他學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，綠僵菌施用后的一段時間內(nèi)，在適應(yīng)新環(huán)境中各種可能的不利因素中宿存量或者存活力出現(xiàn)明顯下降，但仍能維持一定的存活性保證其土壤延續(xù)[12]。陳斌等研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌KMa0107菌株在未滅菌土和滅菌土中的半衰期分別為17和23 d，第56天分生孢子的CFU下降率達(dá)到80%[13]；樊美珍等報道混在土中的分生孢子和菌絲有一部分在13 d內(nèi)即迅速喪失活力，在62 d后各處理的CFU都降低80%以上[9]，程子路等研究不同綠僵菌菌株在土壤中的宿存動態(tài)，也發(fā)現(xiàn)在前30 d各種綠僵菌成菌落數(shù)下降速度較快，均達(dá)到或接近半數(shù)，其后成波動狀態(tài)，自第3個月起，成菌落數(shù)快速降低，最終維持在1 000～10 000 CFUg-1土壤的水平[11]。李興佳等以 Real-Time PCR 方法和平板稀釋法，分別對花生根部施用金龜子綠僵菌后不同時期的土壤進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，施用的金龜子綠僵菌在花生田間呈現(xiàn)先快速下降后緩慢回升的趨勢，90 d時金龜子綠僵菌DNA 量和CFU值均下降至初始的 10%以下，之后出現(xiàn)回升[16]。本研究中綠僵菌在木麻黃林土壤中的宿存趨勢與這些研究基本類似。

目前，關(guān)于綠僵菌菌條上的孢子在林間宿存情況還未見相關(guān)報道。本研究中發(fā)現(xiàn)綠僵菌在45 d內(nèi)孢子量迅速下降，可能是由于菌條綁縛于林間后，受到風(fēng)、雨、其他生物活動等因素造成孢子從菌條上掉落；而后孢子量有一個小幅回升，這可能是由于菌條培養(yǎng)基質(zhì)(土工布吸附)中仍有一些營養(yǎng)成分，在林間環(huán)境濕度較大時，培養(yǎng)基質(zhì)吸水，使得孢子又可利用其營養(yǎng)再次萌發(fā)生長，從而導(dǎo)致孢子量小幅回升，但這種作用有限，隨后孢子量仍逐漸減少。

從孢子萌發(fā)率上來看，菌條暴露在空氣中，其水分、溫度、光照尤其是紫外線等因素復(fù)雜，對其孢子活力影響較大，而土壤環(huán)境(濕度、溫度、紫外線等)較空氣中變化小，所以土壤中的孢子萌發(fā)率可始終保持在一個較高水平，而菌條上的孢子萌發(fā)率變化較為復(fù)雜。何學(xué)友等在研究林間地表松墨天牛僵蟲體上的孢子宿存動態(tài)也發(fā)現(xiàn)綠僵菌孢子在126 d內(nèi)平均萌發(fā)率保持在90%以上[15]。

本研究中關(guān)于綠僵菌的計數(shù)方法是采用直接計數(shù)法，主要是因為綠僵菌孢子形態(tài)特殊(長橢圓形)，在顯微鏡下易于觀察。其他學(xué)者在相關(guān)研究中主要采用CFU法，筆者也曾嘗試使用該方法，但采用相關(guān)報道中的選擇性培養(yǎng)基，未取得理想的分離效果。李興佳等采用Real-Time PCR法，研究了綠僵菌孢子在花生田間土壤中的宿存情況，取得了理想的效果[16]，用分子手段測定綠僵菌的宿存動態(tài)結(jié)果較為可靠與準(zhǔn)確，也是未來發(fā)展的方向，關(guān)于這方面研究有待進(jìn)一步深入。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃金水, 何學(xué)友.中國木麻黃病蟲害[M]．北京: 中國林業(yè)出版社, 2012

[2] 黃金水, 蔡守平, 何學(xué)友, 等. 東南沿海防護(hù)林主要病蟲害發(fā)生現(xiàn)狀與防治策略[J]. 福建林業(yè)科技,2012,39(1):165-170

[3] 蔡守平, 劉建波, 何學(xué)友, 等. 金龜子綠僵菌、球孢白僵菌不同菌株對星天牛成蟲的生物測定[J]. 中國森林病蟲, 2008, 27(2): 1-3,18

[4] 蔡守平. 木麻黃毒蛾高致病力綠僵菌和白僵菌菌株的篩選[J]. 中國森林病蟲,2010, 29(3):4-6,12

[5] 蔡守平, 何學(xué)友, 曾麗瓊, 等. 感染星天牛幼蟲高致病力金龜子綠僵菌菌株的篩選[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2012, 28(2): 293-297

[6] 蔡守平, 何學(xué)友, 曾麗瓊, 等. 白僵菌和綠僵菌林間感染星天牛成蟲試驗[J]. 福建林業(yè)科技, 2013, 40(1): 17-21

[7] 何學(xué)友, 蔡守平, 黃金水, 等. 應(yīng)用綠僵菌和白僵菌林間防治木麻黃毒蛾的初步研究[J]. 福建林業(yè)科技, 2011, 38(2): 10-13

[8] 蒲蟄龍, 李增智．昆蟲真菌學(xué)[M] . 合肥: 安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1996: 592-607

[9] 樊美珍, 李增智. 綠僵菌在土壤中的延續(xù)及控制桃小食心蟲的潛力[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 1996,7(1): 49-55

[10] Guinossi H M, Moscardi F, Oliveira MCN,et al. Spatial dispersal ofMetarhiziumanisopliaeandBeauveriabassianain soybean fields[J]. Tropical Plant Pathology, 2012, 37(1): 44-49

[11] 程子路, 郭立佳, 黃俊生. 綠僵菌在土壤中宿存的數(shù)量及產(chǎn)孢量變化研究[J]. 北京：中國農(nóng)學(xué)通報, 2008，24(7): 365-368

[12] 劉迅. 綠僵菌在土壤中宿存時空動態(tài)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011：27-28

[13] 陳斌, 鄧裕亮, 李正躍, 等. 綠僵菌對小云斑鰓金龜毒力及在土壤中的宿存[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2004, 26(5): 580-583,593

[14] 徐金柱, 何雪香, 秦長生, 等. 綠僵菌無紡布菌條制作工藝[J]. 中國生物防治, 2007, 23(2): 147-150

[15] 何學(xué)友, 黃金水, 蔡守平, 等. 金龜子綠僵菌在松墨天牛成蟲僵蟲體上的宿存動態(tài)[J]. 林業(yè)科學(xué), 2009, 45(12): 77-82

[16] 李興佳, 農(nóng)向群, 曹廣春, 等. 用Real-Time PCR評價花生田間金龜子綠僵菌的存活能力[J]. 菌物學(xué)報, 2013, 32(4): 710-720

Survival Dynamics ofMetarhiziumanisopliaeinCasuarinaequisetifoliaForest

Cai Shouping1,He Xueyou1,Zeng Liqiong1,Su Wenjing2,Huang Jinshui1

(1. The Key Laboratory of Timber Forest Breeding and Cultivation for Mountainous Areas in Southern China,Fujian Academy of Forestry, Fuzhou, 350012，China;2. Forest Pest Control and Quarantine Station of Quanzhou City, Quanzhou 362000, China)

AbstractThe survival dynamics of Metarhizium anisopliae in Casuarina equisetifolia forest were studied through determining CFU and germination rate of spores for Metarhizium anisopliae in fungal band and soil in Casuarina equisetifolia plantation. Result shows that the spores of M. anisopliae were declined very quickly during 45 days after the spores were introduced into the soil. The number of spores is only 30% of the initial number after 45 days. Then the spores decline slowly. Spores on fungal band decline to 30% of the initial number after 30 days, then the spores continue to slowly drop. The germination rate of spores in the soil maintains at a high level during the testing period, while that on fungal band varied complicatedly.

Key wordsspores;fungal band;germination rate; Metarhizium anisopliae ;survival dynamic

中圖分類號：S476.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi:10.13601/j.issn.1005-5215.2016.04.006

作者簡介：蔡守平(1981-)，男，安徽廣德人，碩士，高級工程師，現(xiàn)從事森林害蟲生物防治研究，Email: caishouping@163.com

基金項目：福建省自然基金項目(2014J01096)；福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1011-2)

收稿日期：2016-02-26

文章編號：1005-5215(2016)04-0023-04