柯斌榕吳小平*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002）

赤芝與無柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)特性比較

柯斌榕1,2吳小平1,2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002）

以赤芝Ganoderma lucidum和無柄靈芝Ganoderma resinaceum擔(dān)孢子為材料，從擔(dān)孢子采集方法、萌發(fā)條件及保藏時間等方面，比較兩種擔(dān)孢子的萌發(fā)特性。結(jié)果表明，無柄靈芝擔(dān)孢子在無菌水中培養(yǎng)24 h即可萌發(fā)產(chǎn)生芽管，48 h萌發(fā)率為6.77%；而赤芝只有早期彈射的新鮮擔(dān)孢子可以在麥芽汁培養(yǎng)基中萌發(fā)，但萌發(fā)率僅有1.13%。赤芝擔(dān)孢子根據(jù)形態(tài)大小可分為3類，其中可萌發(fā)擔(dān)孢子的平均長為7.38 μm，寬為4.46 μm，小于成熟擔(dān)孢子，細胞壁顏色也比成熟擔(dān)孢子淺。靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)時一般在擔(dān)孢子頂端或臍狀處產(chǎn)生一個芽管，極少數(shù)兩處同時產(chǎn)生芽管。新生菌絲在不適宜繼續(xù)生長條件下，可進一步形成厚垣孢子；且隨著擔(dān)孢子保藏時間的延長，其萌發(fā)率快速降低。

赤芝；無柄靈芝；擔(dān)孢子；萌發(fā)率

靈芝又名赤芝、靈芝草，是我國最著名的藥用真菌，因其所具有的獨特功效為世人所稱頌。早在2 000多年前，我國便有了靈芝的記載，從《山海經(jīng)》到《白蛇傳》，從《神農(nóng)本草經(jīng)》到《本草綱目》都有關(guān)于靈芝的傳說和藥效的描述[1]。上世紀(jì)70年代，林志彬在對靈芝藥理和臨床研究過程中提出靈芝有“扶正固本”的作用機制，并在長期的研究中證明并完善了這一理論[2]。隨著靈芝的功效不斷為人所知，市場逐步擴大，與此同時人們對靈芝產(chǎn)品質(zhì)量要求也不斷提高。我國靈芝新品種主要靠野生采集馴化獲得，近年來物理誘變[3]，原生質(zhì)體融合[4]及原生質(zhì)體單核化[5]等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靈芝品種的改良，但因赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)比較困難，限制了其擔(dān)孢子遺傳多樣性的利用和開發(fā)。

本研究比較了國內(nèi)廣泛栽培的赤芝和無柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)特性，以期了解靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)規(guī)律，進而獲得由擔(dān)孢子萌發(fā)的單核菌株的方法，為靈芝遺傳分析與新品種選育和改良打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

赤芝、無柄靈芝菌株來源于福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基：取波美度為4度的麥芽汁200 mL加水定容至1 L，121 ℃下滅菌30 min；馬鈴薯液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水l 000 mL，pH自然，121 ℃下滅菌30 min；袋料栽培培養(yǎng)基：75%雜木屑，20%麩皮，3%玉米粉，1%石膏粉，1%輕質(zhì)碳酸鈣，高壓滅菌2 h。

1.3 擔(dān)孢子采集與觀察

栽培包菌絲滿袋后，進行岀芝管理，選取分化正常的子實體進行信封套袋收集孢子。套袋前預(yù)先放置一張硫酸紙在信封中，并進行滅菌處理。套袋時要注意子實體菌管層不能與硫酸紙接觸，留一定的空間以利于子實體彈射孢子。每天查看是否有孢子彈射，如有孢子彈射即可進行萌發(fā)處理。以光學(xué)顯微鏡和電子掃描顯微鏡觀察擔(dān)孢子。

1.4 擔(dān)孢子萌發(fā)處理

圖1 赤芝和無柄靈芝的擔(dān)孢子形態(tài)

將獲得的靈芝孢子用裝有1 mL無菌水的離心管進行稀釋，振蕩均勻，形成孢子懸浮液，吸取少許懸浮液于顯微鏡下觀察，控制孢子在10倍物鏡視野里面的數(shù)量在100～200個之間。最后各取100 μL分別裝入含有0.9 mL馬鈴薯液體的培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中，并用無菌水作為對照處理。封口后放在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次。當(dāng)靈芝孢子萌發(fā)出芽管時，即可認為該孢子萌發(fā)，并計算萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子總數(shù)/孢子總數(shù)×100%。試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.5 孢子大小測定

依據(jù)吳曉航的方法[6]加以改進，用顯微拍照系統(tǒng)對孢子及鏡臺測微尺拍照，利用等比例測量原理測定孢子的大小。

2 結(jié)果分析

2.1 兩種靈芝擔(dān)孢子形態(tài)觀察

圖1為兩種擔(dān)孢子光學(xué)及掃描電子顯微鏡圖片，可以看出赤芝擔(dān)孢子呈卵圓形或頂端平截，具有雙層壁，外壁透明，平滑，內(nèi)壁淡褐色或近褐色，有小刺，有時中間有油滴狀物。掃描電鏡下可見擔(dān)孢子表面有凹陷或少量孔道，孢子基部有臍狀附屬物，成熟擔(dān)孢子大小為8.8～9.9×5.0～6.0（μm）。

無柄靈芝擔(dān)孢子呈卵形，與赤芝孢子相類似，但略大于赤芝孢子，頂部透明塞狀結(jié)構(gòu)較赤芝小。具有雙層細胞壁，外壁透明，平滑，近無色至淡褐色，中間可見有油滴。掃描電鏡下可見孢子表面有明顯的孔洞，孢子基部有臍狀附屬物，成熟擔(dān)孢子大小為8.5～10.0×6.5～7.0（μm）。

2.2 不同萌發(fā)處理對孢子萌發(fā)的影響

不同萌發(fā)處理試驗，赤芝擔(dān)孢子只在麥芽汁培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)30 h后，才能觀察到有孢子萌發(fā)（圖2A），48 h后萌發(fā)率為1.13%；而無柄靈芝擔(dān)孢子在無菌水中24 h就可萌發(fā)（圖2B），在無菌水、馬鈴薯液體培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中48 h的萌發(fā)率分別為6.78%、12.07%和23.39%。另還發(fā)現(xiàn)，赤芝擔(dān)孢子只有收集早期新鮮彈射的，才能觀察到萌發(fā)，子實體成熟期彈射的擔(dān)孢子未見萌發(fā)；而無柄靈芝擔(dān)孢子，不論收集哪個階段的擔(dān)孢子都能夠萌發(fā)，且萌發(fā)率不相上下。

圖2 赤芝與無柄靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)形態(tài)

圖3 無柄靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)過程

2.3 靈芝擔(dān)孢子萌發(fā)特性

赤芝和無柄靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)過程基本相同，大多先在擔(dān)孢子頂端開始出現(xiàn)芽管或膨大為球狀的芽管（圖3A），進而形成單根或多根新生菌絲（圖3B，C）。也發(fā)現(xiàn)少數(shù)的芽管在底部臍狀處（圖3D），或在擔(dān)孢子頂部和臍狀處同時形成（圖3E）。萌發(fā)過程中擔(dān)孢子仍保存完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，逐漸變?yōu)橥该髦锌諣顟B(tài)。此外，無柄靈芝擔(dān)孢子在水中萌發(fā)后，菌絲能夠利用孢子自身營養(yǎng)物質(zhì)快速生長，并在后期營養(yǎng)不足時形成大量膨大厚壁的厚垣孢子（圖3F）。

2.4 赤芝擔(dān)孢子大小與萌發(fā)率關(guān)系

通過比較萌發(fā)孢子與未萌發(fā)孢子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)赤芝具有萌發(fā)能力的孢子顏色較淺且孢子較小，而無柄靈芝未萌發(fā)的孢子與萌發(fā)的孢子則沒有差別。采用顯微測量比較未萌發(fā)與萌發(fā)的赤芝擔(dān)孢子，可以將早期新鮮彈射的赤芝擔(dān)孢子分為三類（圖4）：第Ⅰ類為發(fā)育成熟的擔(dān)孢子，其平均長為9.74μm，寬為5.56 μm，屬典型瓜子形（圖5B），該類擔(dān)孢子不能萌發(fā)，占總數(shù)的80.43%；第Ⅱ類為發(fā)育不良的擔(dān)孢子，其平均長為7.85 μm，寬為3.78 μm，呈細長形（圖5C），該類擔(dān)孢子也不能萌發(fā)，占總數(shù)的13.87%；第Ⅲ類擔(dān)孢子平均長為7.38 μm，寬為4.46 μm，呈近橢圓形（圖5D），該類擔(dān)孢子可萌發(fā)，占總數(shù)的5.70%。此外，隨著赤芝子實體不斷發(fā)育成熟，所彈射的孢子中Ⅰ類孢子所占比重加大，Ⅲ類孢子所占比例下降。

2.5 孢子保藏時間與萌發(fā)率的關(guān)系

試驗過程中發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)率與保藏天數(shù)關(guān)系密切。赤芝擔(dān)孢子室溫避光放置一天就很難觀察到孢子萌發(fā)，而無柄靈芝擔(dān)孢子室溫保藏4天仍有3.19%的萌發(fā)率（圖6）。因此赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)實驗時，應(yīng)采用當(dāng)天收集的擔(dān)孢子。

圖4 赤芝三類擔(dān)孢子大小及所占比例

圖5 不同大小的赤芝孢子形態(tài)

圖6 無柄靈芝擔(dān)孢子不同保藏時間的萌發(fā)率

3 討 論

靈芝擔(dān)孢子作為靈芝的有性孢子，不僅可以作為一種保健品，而且是靈芝品種改良和遺傳分析的重要材料。在光學(xué)顯微鏡下觀察無柄靈芝和赤芝的擔(dān)孢子，其形態(tài)相近，如果不加以細致區(qū)分有可能造成混淆。掃描電鏡可以看見無柄靈芝的細胞壁表面有較多的孔道，明顯區(qū)別于赤芝擔(dān)孢子。靈芝屬真菌其擔(dān)孢子都具有雙層細胞壁結(jié)構(gòu)，但不同靈芝種間的擔(dān)孢子形狀與構(gòu)造不盡相同。不同的細胞壁結(jié)構(gòu)與表面孔道和紋飾，可以用于區(qū)分不同種的靈芝，同時結(jié)構(gòu)差異也可能影響孢子的萌發(fā)率。Leslie在進行靈芝孢子結(jié)構(gòu)研究時指出，孢子的雙層厚壁結(jié)構(gòu)可能會阻礙孢子的萌發(fā)[7]。

通過比較赤芝和無柄靈芝的擔(dān)孢子萌發(fā)特性，發(fā)現(xiàn)二者在擔(dān)孢子萌發(fā)率上差異很大，且萌發(fā)處理條件也有區(qū)別。赤芝的擔(dān)孢子不僅萌發(fā)率低，且對擔(dān)孢子收集的時間和處理的方法都有一定要求。在收集擔(dān)孢子的過程中還發(fā)現(xiàn)，與常見傘菌子實體不同，靈芝只有生長中的子實體才能彈射擔(dān)孢子，而采收下來的子實體則不能通過彈射收集到孢子。盡管在實驗條件下很早就觀察到赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)，并測定萌發(fā)率在1%～2%之間[8～10]，但也有很多不成功的案例[11,12]。也有研究表明赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)率可達到8%～15%或70%[13,14]。由于近年來研究表明靈芝G. lucidum與我國廣泛栽培的赤芝并不是相同的種[15]，所以前人研究所用的品種是否與本研究相同很難確定。

不同種靈芝擔(dān)孢子的萌發(fā)率差異很大，如本研究中的無柄靈芝孢子的萌發(fā)達到23.39%；狹長孢靈芝Ganoderma boninense擔(dān)孢子在多種培養(yǎng)基中都可以萌發(fā)，48 h最大萌發(fā)率可達97.5%[16]。因此靈芝間截然不同的擔(dān)孢子萌發(fā)率，可能暗示著它們在擔(dān)孢子傳播上的不同策略。一類是通過高萌發(fā)率來保證傳播的成功率；另一類是通過采用在特定條件下萌發(fā)以克服不利條件，如赤芝成熟擔(dān)孢子較厚的細胞壁既有利于承受傳播過程中不利環(huán)境的影響，也能夠在通過昆蟲消化系統(tǒng)以后仍有較大的存活機率，進而保證擔(dān)孢子的傳播。

實驗中發(fā)現(xiàn)赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)與其孢子大小和孢子顏色有關(guān)，很可能是因為萌發(fā)的孢子個體小、細胞壁發(fā)育還不完全，可以在適合條件下萌發(fā)。赤芝擔(dān)孢子的萌發(fā)率與孢子采集的新鮮程度以及萌發(fā)處理方式有密切關(guān)系，用于萌發(fā)實驗的孢子最好是靈芝子實體最早彈射的一批孢子。有人認為做萌發(fā)實驗時應(yīng)選用后期釋放的孢子，認為后期擔(dān)孢子細胞壁幾丁質(zhì)程度較低有利于擔(dān)孢子萌發(fā)[13]。Nuss通過對靈芝孢子萌發(fā)規(guī)律的研究指出，前期孢子萌發(fā)迅速，而后期彈射的孢子必須先通過昆蟲的腸道消化才能萌發(fā)[17]。這一點也在橡膠靈芝Ganoderma pseudoferreum擔(dān)孢子喂養(yǎng)大蚊幼蟲的實驗中得到證明[18]。借助于本研究能夠獲得赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)的單核菌株，可以用于遺傳分析和品種改良工作，而如何打破成熟赤芝擔(dān)孢子的休眠，提高其萌發(fā)率，則還需要作進一步的研究。

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Characteristics comparison of basidiospore germination of Ganoderma lucidum and Ganoderma resinaceum

Ke Binrong1,2Wu Xiaoping1,2*
（1. School of Life Sciences of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China；2. Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002,China）

Based on the materials of the basidiospores of Ganoderma lucidum and Ganoderma resinaceum, the germination characteristics were compared in the aspects of the collecting methods, germination conditions, storage time and etc. The results showed that the basidiospores G. resinaceum germinated germ tubes in 24h in the sterile water, and after 48h the germination rate reached to 6.77%. And only the fresh catapulting basidiospores could germinate in wort medium though the germination rate of G. lucidum was just 1.13%. According to the size and morphology, the basidiospores of G. lucidum can be divided into three categories. The average length and width of germinable G. lucidum basidiospores were 7.38μm and 4.46μm， respectively， smaller than the mature basidiospores. And the color of the cell walls was aslo lighter than that of the mature basidiospores. The germination process was featured with a germ tube on the top of basidiospores or in the hilum, in rare cases one germ tube in each part. If the conditions were not fit for mycelium growth, chlamydospore would take shape. With the storage time goes on, the germination rate will fall rapidly.

Ganoderma lucidum; Ganoderma resinaceum; basidiospore; germination rate

S567.3+1

A

2095-0934（2015）05-282-06

福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程專項項目“靈芝種業(yè)創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化工程”（項目編號：2014S1477-21）

柯斌榕（1986—），男，福建農(nóng)林大學(xué)2010級碩士研究生，現(xiàn)分配福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所工作

吳小平（1965—），博士，教授，主要從事食藥用菌教學(xué)及科研工作。E-mail：fjwxp@126.com