周香艷，張寧，劉柏林，裴瑞芳,3，司懷軍,3*，王蒂

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省作物遺傳改良與

種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730070)

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ARF基因干擾表達對不同發(fā)育階段和貯藏條件馬鈴薯酶活性的影響

周香艷1,2，張寧1，劉柏林2,3，裴瑞芳1,3，司懷軍1,3*，王蒂2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省作物遺傳改良與

種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730070)

摘要：以前期研究獲得的馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯2號”ADP核糖基化因子(ARF)基因干擾表達轉化植株為材料，用qRT-PCR法對轉基因植株的ARF基因表達量進行了測定，結果表明，不同發(fā)育階段轉基因葉片中ARF基因的相對表達量先降低，生長后期略有增加，表明ARF基因干擾表達量隨馬鈴薯生長發(fā)育發(fā)生改變。ARF基因干擾表達影響馬鈴薯葉片中酶活性，不同發(fā)育階段轉基因葉片與對照相比，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性升高11.61%～27.84%，硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)活性提高21.10%～41.32%，磷脂酶D(phospholipase D, PLD)活性降低2.88%～57.64%，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)活性提高29.00%～39.57%；不同溫度(4℃和室溫)貯藏的塊莖中ARF基因的相對表達量變化趨勢一致：均先降低，再升高，但前者較后者ARF基因相對表達量顯著降低。室溫較4℃貯藏的轉基因塊莖PPO活性升高30.44%～56.28%，NR活性提高17.41%～40.92%，PLD活性降低24.39%～85.11%，SPS活性提高30.89%～45.78%。室溫較4℃貯藏的非轉基因塊莖PPO活性升高25.11%～70.66%，NR活性提高36.07%～89.62%，PLD活性降低11.35%～72.64%，SPS活性提高27.31%～61.33%。本研究通過探討ARF基因干擾表達對馬鈴薯生理生化特性的影響，為進一步研究ARF基因在馬鈴薯生長發(fā)育調(diào)控中的作用提供一定的理論基礎。

關鍵詞：馬鈴薯；ARF基因；干擾表達；轉基因植株；酶活性

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)是Ras基因超家族的成員，它們是大小約20 kDa的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，屬于小G蛋白超家族中的ARF亞家族[1-2]。ARF于1982年被Kahn和Gilman[3]最早發(fā)現(xiàn)并純化出該類細胞因子，將其命名為ARF，其普遍存在于真核生物細胞中，結構和功能在動植物演化發(fā)展中高度保守[4]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)ARF的重要生理功能之一是作為磷脂酶D的激活劑[5-6]。馬鈴薯(Solanumtuberosum)具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應性強等優(yōu)良特性以及隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷壯大和人們消費結構的變化，馬鈴薯品質(zhì)育種工作正在受到重視[7]。

在前期研究中獲得了ARF基因干擾表達轉基因馬鈴薯植株[8]，Zuk等[9]推測ARF基因的抑制表達會激活14-3-3蛋白基因，14-3-3蛋白基因對硝酸還原酶和蔗糖轉化酶的活性有一定的影響，同時會使具有抗氧化能力的酚類物質(zhì)含量降低。為此，本研究通過對馬鈴薯ARF干擾表達植株的ARF基因相對表達量、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)、磷脂酶D(phospholipase D, PLD)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)活性進行測定，研究ARF基因干擾表達對以上酶活性變化的影響，以期闡明ARF基因對馬鈴薯生理生化特性影響的機理，從而為進一步研究ARF基因在馬鈴薯生長發(fā)育調(diào)控中的作用提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

ARF基因干擾表達載體pHellsgatearf1(含組成型表達啟動子CaMV35S)由甘肅農(nóng)業(yè)大學劉柏林博士構建，抗性標記為卡那霉素(kanamycin，Kan)和壯觀霉素(spectinomycin，Spe)。馬鈴薯品種“甘農(nóng)薯2號”轉ARF基因干擾表達載體轉基因株系Z-12(干擾程度為93.22%)微型薯[8]，由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供。于 2014 年6月5日，在甘肅農(nóng)業(yè)大學溫室將轉基因和未轉基因馬鈴薯微型薯種植于直徑為18 cm的花盆中，每盆4株。采用自然光照，生長期間保證植株正常生長的水肥要求。

1.2方法

1.2.1轉基因植株實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測對于溫室種植的每個植株，生長30 d后，每15 d采取植株葉片，迅速用液氮冷凍，保存于-80℃冰箱中。收獲后，每15 d采取不同貯存條件下(室溫和4℃)的馬鈴薯塊莖，迅速用液氮冷凍，保存于-80℃冰箱中。對不同發(fā)育階段的馬鈴薯葉片和采收后不同貯存條件下(室溫和4℃)的馬鈴薯塊莖，分別提取植株的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑進行反轉錄，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。以馬鈴薯ef1a基因為內(nèi)參(擴增引物為ef1a-F：5′-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3′和ef1a-R：5′-TTCCTTACCTGAACGCCTGT-3′)，以ARF基因序列設計1對特異性引物ARF-F：5′-GCCTTACCCTTCTTCACTCTCT-3′和ARF-R：5′-CCCATTCCAACATCAGACAC-3′。重復3次，利用SYBR熒光染料法進行轉基因植株的qRT-PCR檢測與分析，根據(jù)2-ΔΔCt方法[10]計算ARF基因的相對表達量。基因表達分析均以對照為參照進行相對表達比較[11]。計算公式為：RQ(相對表達量)=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(ΔCt處理樣品-ΔCtef1a)-(ΔCt對照樣品-ΔCtef1a)。

1.2.2轉基因植株酶活性測定測定不同發(fā)育階段馬鈴薯葉片和不同貯存條件下(室溫和4℃)馬鈴薯塊莖的酶(PPO、NR、PLD和SPS)活性。PPO活性測定用比色法[12]，NR活性測定用活體比色法[13]，PLD活性測定用酶聯(lián)比色法[14]，SPS活性測定用蒽酮比色法[15]。

圖1　轉基因植株ARF基因表達的qRT-PCR檢測Fig.1　Result of ARF gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay　　　A,B分別代表不同發(fā)育階段葉片、室溫和4℃儲藏塊莖ARF基因在不同時期的相對表達量。馬鈴薯ef1a基因作為內(nèi)參，開始處理第0天基因的表達水平被設定為1，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。誤差線表示3個獨立實驗的標準偏差，使用鄧肯氏新復極差法檢驗差異顯著性，不同小寫字母表示0.05水平差異顯著。A,B represents relative expression quality of ARF gene of transgenic plants in different developmental stages and in storage tubers under different storage temperature (room temperature and 4℃). The ef1a gene was chosen as endogenous control for ARF gene.The expression level of each treatment in 0 day was set as 1, and the relative levels in the following days were quantified using the 2-ΔΔCt method. The error bars indicated the standard deviations obtained from three independent experiments.The assay was performed based on Duncan’s new multiple range test. The lower-case letters represent statistically significant differences at the 0.05 level.

1.3數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次，采用Microsoft Excel 2003進行繪圖與數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2結果與分析

2.1轉基因植株的qRT-PCR檢測與分析

以馬鈴薯ef1a基因為內(nèi)參，采用qRT-PCR法對馬鈴薯不同發(fā)育階段的葉片和不同貯藏溫度(室溫和4℃)的塊莖中ARF基因的相對表達量進行了檢測。結果表明，不同發(fā)育階段轉基因和未轉基因葉片中ARF基因的相對表達量均逐漸降低，轉基因葉片較同一生長期未轉基因葉片ARF基因相對表達量低(圖1A)。室溫貯藏的轉基因微型薯塊莖中ARF基因相對表達量先降低，75 d后逐漸升高，后期略有下降，而未轉基因微型薯塊莖中ARF基因相對表達量也先降低，貯藏60 d后開始增加(圖1B)；4℃與室溫貯藏無論轉基因還是未轉基因微型薯中ARF基因相對表達量變化趨勢一致，但前者相對表達量顯著低于后者(圖1B)。

2.2不同發(fā)育階段轉ARF基因與未轉基因馬鈴薯葉片酶活性變化

馬鈴薯微型薯種植30 d 后，每15 d采取植株葉片進行相關酶活性的測定。結果表明，轉基因與未轉基因馬鈴薯葉片中，PPO和NR活性隨生長發(fā)育不同，變化趨勢一致，均為先升高后降低，但PPO在成熟期才開始降低，而NR在生長90 d左右開始降低(圖2)。二者在對照中酶活性均低于基因干擾表達葉片中的酶活性。對照PLD活性先升高，后降低，再升高；轉基因馬鈴薯葉片PLD持續(xù)升高，但其含量低于對照(圖2)。SPS先升高后降低再升高，對照中酶活性均低于基因干擾表達葉片中的酶活性(圖2)。不同發(fā)育階段轉基因葉片與對照相比，PPO酶活性升高11.61%～27.84%，NR活性提高21.10%～41.32%，PLD活性降低2.88%～57.64%，SPS活性提高29.00%～39.57%。

2.3貯藏溫度對轉ARF基因和未轉基因馬鈴薯酶活性影響

收獲后，每15 d采取不同貯存條件下(室溫和4℃)的馬鈴薯塊莖，測定其酶活性。結果表明，不同貯藏溫度(室溫和4℃)下， 轉基因與非轉基因馬鈴薯4種酶酶活性變化趨勢基本一致。 室溫和4℃貯藏的轉ARF基因馬鈴薯PPO活性先升高， 生長75 d左右開始呈下降趨勢(圖3)， 室溫較4℃ 貯藏的轉基因塊莖PPO活性升高30.44%～56.28%，非轉基因塊莖PPO活性升高25.11%～70.66%； NR活性均呈下降變化趨勢(圖4)， 轉基因塊莖NR活性提高17.41%～40.92%，非轉基因塊莖NR活性提高36.07%～89.62%；PLD活性均先增高后降低(圖5)，轉基因塊莖PLD活性降低24.39%～85.11%，非轉基因塊莖PLD活性降低11.35%～72.64%；SPS活性均先升高后降低再升高(圖6)，轉基因塊莖SPS活性提高30.89%～45.78%，非轉基因塊莖SPS活性提高27.31%～61.33%。

圖2　不同發(fā)育階段轉ARF基因與未轉基因(CK)馬鈴薯葉片酶活性變化比較Fig.2　Comparison of enzyme activity of transgenic and non-transgenic leaves of potato under different developmental stage

圖3　室溫和 4℃貯藏下轉ARF基因與未轉基因馬鈴薯PPO活性變化Fig.3　Comparison of PPO activity of transgenic and non-transgenic tubers under different storage temperature (room temperature and 4℃)

圖4　室溫和 4℃貯藏下轉ARF基因與未轉基因馬鈴薯NR活性變化Fig.4　Comparison of NR activity of transgenic and non-transgenic tubers under different storage temperature (room temperature and 4℃)

圖5　室溫和 4℃貯藏下轉ARF基因與未轉基因馬鈴薯PLD活性變化Fig.5　Comparison of PLD activity of transgenic and non-transgenic tubers under different storage temperature (room temperature and 4℃)

圖6　室溫和4℃貯藏下轉ARF基因與未轉基因馬鈴薯SPS活性變化Fig.6　Comparison of SPS activity of transgenic and non-transgenic tubers under different storage temperature (room temperature and 4℃)

3討論

轉基因技術是研究基因功能的基本手段，本研究測定了不同發(fā)育階段葉片和不同貯藏溫度微型薯ARF基因表達量和4種酶(PPO、NR、PLD和SPS)活性，與對照相比，轉基因株系不同發(fā)育階段葉片和不同貯藏溫度試管薯的酶活性均有變化。不同發(fā)育階段的葉片干擾相對表達量逐漸降低，說明干擾表達程度隨著葉片的生長發(fā)育呈增強趨勢。室溫貯藏的轉基因和未轉基因微型薯塊莖中ARF基因相對表達量主要呈先降低，后逐漸升高的趨勢。4℃與室溫貯藏無論轉基因還是未轉基因微型薯中ARF基因相對表達量變化趨勢一致，但前者相對表達量顯著低于后者。結果表明，貯藏溫度會影響塊莖中ARF基因的干擾表達程度，4℃貯藏時，干擾程度較明顯，而室溫貯藏時，隨著時間的延續(xù)，干擾程度減弱。Liu等[16]研究分析表明ARF基因在馬鈴薯塊莖中表達量最高，本研究也發(fā)現(xiàn)塊莖中的表達量高于葉片。

酶是影響代謝的基本因素，是活細胞內(nèi)能催化生化反應的生物催化劑，酶的活性變化是植物體內(nèi)生理活性變化的具體反映。新收獲的馬鈴薯塊莖在整個貯藏期間，從休眠到休眠解除、頂芽萌發(fā)生長，要經(jīng)過一系列的物質(zhì)分解和合成，期間都是在相應酶的作用下引起的各種變化[17]。PPO僅在塊莖休眠時活性較高，頂芽萌動后酶活性迅速下降，是塊莖休眠期間分生組織呼吸作用的末端氧化酶系統(tǒng)[18]。SPS在蔗糖代謝中起著重要的作用，它不但是合成蔗糖的關鍵酶之一，還是光合產(chǎn)物向蔗糖和淀粉分配的調(diào)控關鍵點，所以它既影響植物生長發(fā)育，又調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物在蔗糖和淀粉之間的分配，同時它還參與細胞分化與纖維細胞壁合成[19]。大量研究也證明了SPS活性對作物生育、抗老、物質(zhì)分配等方面都有積極的影響。Doehlert和Huber[20]對大豆的研究表明SPS是大豆葉片中蔗糖合成的關鍵酶，也有研究指出SPS在小麥旗葉光合產(chǎn)物向蔗糖轉化過程中也起到關鍵調(diào)節(jié)作用[21]。NR是高等植物氮代謝過程中的一個重要的調(diào)節(jié)酶和限速酶。土壤水分過低或過高都不利于硝酸還原酶活性和蔗糖轉化酶活性的提高，在塊莖形成、膨大期，馬鈴薯植株需水肥最多，吸收礦質(zhì)營養(yǎng)也較多，因此，NR的活性逐漸加強，后期又有所下降[22]。

不同發(fā)育階段，轉基因與未轉基因馬鈴薯葉片中， PPO和NR活性變化趨勢一致，均先升高后降低，但PPO在成熟期才開始降低，而NR在生長90 d左右開始降低。二者在對照中酶活性均低于基因干擾表達葉片。對照PLD活性先升高，后降低，再升高；轉基因馬鈴薯葉片持續(xù)升高，但其含量低于對照。SPS先升高后降低，再升高，對照中酶活性均低于基因干擾表達葉片。不同發(fā)育階段轉基因葉片與對照相比，PPO、NR和SPS活性均升高，PLD活性降低，這與Zuk等[9]的研究結果一致。Zuk等[9]證實，抑制馬鈴薯ARF基因的表達會導致14-3-3蛋白基因的激活，14-3-3蛋白基因對NR和SPS的活性有一定的影響，同時會使具有抗氧化能力的酚類物質(zhì)含量降低。本研究中，ARF基因干擾表達時，PPO的活性升高，會催化更多的酚類物質(zhì)轉化為醌類物質(zhì)，因此酚類物質(zhì)含量降低。ARF的重要生理功能之一是作為PLD的激活劑[5-6]，本研究中ARF基因的表達受到干擾，導致PLD 的活性降低。

貯藏溫度會影響轉基因和未轉基因馬鈴薯酶活性，這與Zuk等[9]、Brown等[5]和Orci等[6]的研究結果相一致。不同貯藏溫度(室溫和4℃)下，轉基因與非轉基因馬鈴薯4種酶酶活性變化趨勢基本一致。無論轉基因還是非轉基因植株，室溫較4℃貯藏的塊莖，PPO、NR和SPS活性均升高，只有PLD活性下降。研究表明，玉米[23]、菠菜、胡蘿卜[24]、刺槐[25]等多種植物在冷害條件下，PLD 活性均升高。PLD活性在低溫下升高的機理有待進一步研究。

4結論

馬鈴薯ARF基因干擾表達轉基因植株中，在不同發(fā)育階段和不同貯藏溫度下ARF基因的干擾程度不同，導致轉基因和未轉基因植株PPO、NR、PLD和SPS活性均發(fā)生了不同程度的變化。研究結果為進一步研究ARF基因在馬鈴薯生長發(fā)育調(diào)控中的作用奠定了基礎。

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Effects of RNAi expression of theARFgene on enzyme activity at different developmental stages and storage temperatures in potato

ZHOU Xiang-Yan1,2, ZHANG Ning2, LIU Bai-Lin2,3, PEI Rui-Fang1,3, SI Huai-Jun1,3*, WANG Di2,3

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 3.GansuKeyLaboratoryofCropGeneticandGermplasmEnhancement,GansuProvincialKeyLaboratoryofAridlandCropScience,Lanzhou730070,China

Abstract:ADP ribosylation factor (ARF) gene expression interference in a transformed potato cultivar “Gannongshu 2” was evaluated. Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) showed that the relative expression of the ARF gene varied in the transgenic plants at different developmental stages and increased slightly at latter growth stages, indicating that ARF gene interference expression varied with maturity.Enzyme activity in the leaves was effected by ARF gene interference expression. For leaves of transgenic plants at different development stages, PPO activity increased by 11.61%-27.84%, NR activity increased by 21.10%-41.32%, PLD activity decreased 2.88%-57.64% SPS activity increased by 29.00%-39.57% when compared with the control. Relative expression of the ARF gene in stored tubers under different storage temperatures (room temperature and 4℃)showed the same trend; initially decreasing and then increasing. For transgenic tubers stored at room temperature, the activity of PPO increased by 30.44%-56.28%, NR activity increased by 17.41%-40.92%, PLD activity decreased 24.39%-85.11%, SPS activity increased by 30.89%-45.78% when compared with transgenic tubers stored at 4℃. For non-transgenic tubers stored at room temperature, PPO activity increased by 25.11%-70.66%, NR activity increased by 36.07%-89.62%, PLD activity decreased 11.35%-72.64% and SPS activity increased by 27.31%-61.33%.This study investigated the effect of RNAi expression of ARF gene on physiological and biochemical characteristics in potato to provide a theoretical basis for further study of the regulation role of the ARF gene in potato of different growth and stage of development.

Key words:potato; ARF gene; interference expression; transgenic plants; enzyme activity

*通信作者

Corresponding author. E-mail: hjsi@gsau.edu.cn

作者簡介：周香艷(1983-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，在讀博士。E-mail: zhxy2008bj@163.com

基金項目：甘肅農(nóng)業(yè)大學盛彤笙科技創(chuàng)新基金項目(GSAU-STS-1333)，國家自然科學基金項目(31160298)，甘肅省杰出青年基金項目(1308RJDA011)和甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(GNCX-2012-49)資助。

*收稿日期：2015-04-14；改回日期：2015-07-06

DOI：10.11686/cyxb2015194

http://cyxb.lzu.edu.cn

周香艷, 張寧, 劉柏林, 裴瑞芳, 司懷軍, 王蒂.ARF基因干擾表達對不同發(fā)育階段和貯藏條件馬鈴薯酶活性的影響. 草業(yè)學報, 2016, 25(4): 133-139.

ZHOU Xiang-Yan, ZHANG Ning, LIU Bai-Lin, PEI Rui-Fang, SI Huai-Jun, WANG Di. Effects of RNAi expression of theARFgene on enzyme activity at different developmental stages and storage temperatures in potato. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 133-139.