黃艷艷，高丹丹，許傳田，朱曼玲，楊少華，黃慶華，張　琳，張秀美，吳家強(qiáng)*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟(jì)南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東泰安 271018)

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雞三種天然免疫相關(guān)受體和配體熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

黃艷艷1,2，高丹丹3，許傳田1,2，朱曼玲1,2，楊少華1,2，黃慶華1,2，張琳1,2，張秀美1,2，吳家強(qiáng)1,2*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟(jì)南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 山東泰安 271018)

摘要：為建立檢測雞天然免疫相關(guān)受體(Ch-MDA5、Ch-TLR3和Ch-TLR7)及其相應(yīng)配體(MAVS、TRIF和MyD88)的熒光定量PCR方法并評價其應(yīng)用效果，設(shè)計和篩選特異性PCR引物，制備各基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，繪制熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性進(jìn)行檢驗。結(jié)果表明，所建立的檢測方法敏感度高、特異性強(qiáng)、檢測線性范圍廣、重復(fù)性好。應(yīng)用建立的方法檢測新城疫油乳劑滅活苗免疫SPF雞后上述基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)免疫后6 h各基因的表達(dá)水平達(dá)到峰值，表明疫苗免疫迅速有效地激活了機(jī)體的天然免疫應(yīng)答。建立了與雞抗病毒感染天然免疫相關(guān)的3種細(xì)胞受體和相應(yīng)配體的定量檢測方法，可應(yīng)用于病毒致病機(jī)制、雞用新型疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及抗病毒藥物的研究與開發(fā)。

關(guān)鍵詞：雞；天然免疫；受體與配體；檢測；實時熒光定量PCR

天然免疫已逐漸成為獸醫(yī)免疫學(xué)研究中一個活躍的領(lǐng)域。研究表明，雞黑色素瘤分化相關(guān)抗原5(chicken melanoma differentiation-associated protein 5，Ch-MDA5)[1]、雞Toll樣受體3(chicken Toll-like receptor 3，Ch-TLR3)[2]和雞Toll樣受體7(chicken toll-like receptor 7，Ch-TLR7)[3]是雞體識別RNA病毒感染的主要模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)。Ch-TLR3和Ch-MDA5可以識別病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)，而Ch-TLR7則識別單鏈RNA(ssRNA)[4]。上述天然免疫受體與其特異性配體結(jié)合后，啟動雞體天然免疫的信號級聯(lián)傳導(dǎo)：起始轉(zhuǎn)錄因子的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化因子及干擾素，并最終促進(jìn)抗病毒物質(zhì)的產(chǎn)生[5-6]。其中，Ch-MDA5依賴于線粒體抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮作用,Ch-TLR3通過TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon B，TRIF)依賴的信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，而Ch-TLR7通過髓樣分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)依賴的信號通路起作用[7]。

檢測病毒感染或疫苗免疫對雞天然免疫信號通路相關(guān)分子的影響，對于深入了解病毒的致病機(jī)制，研究開發(fā)雞用新型疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及抗病毒藥物，均具有非常重要的意義。熒光定量PCR(qPCR)方法具有敏感、快速、實時和所需檢測樣品少等優(yōu)點，是目前對基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。此類方法用于雞天然免疫信號通路中相關(guān)受體、配體、細(xì)胞因子及效應(yīng)分子的標(biāo)準(zhǔn)化檢測, 將為相關(guān)的科學(xué)研究帶來極大的便利。本研究旨在建立檢測Ch-MDA5、Ch-TLR3、Ch-TLR7、MAVS、TRIF和MyD88轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR(qPCR)方法，并將其用于檢測疫苗免疫SPF雞后相應(yīng)基因的表達(dá)變化，以驗證所建立的方法的實際應(yīng)用效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株及疫苗新城疫病毒弱毒疫苗株(La Sota)，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存；新城疫油乳劑疫苗，齊魯制藥有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑Trizol、TE緩沖液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶PCR試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Qiagen公司產(chǎn)品；pUC57載體、Dpα感受態(tài)細(xì)胞，熒光定量PCR預(yù)混液(Master Mix)和緩沖液(buffer)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；一次性蝶形采血針、EDTA抗凝真空采血管，北京美科美加生物科技有限公司產(chǎn)品；雞外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)分離試劑盒，天津市灝洋生物制品科技有限公司(TBD)產(chǎn)品。

1.1.3實驗動物3周齡SPF白色來航雞，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心，經(jīng)環(huán)境適應(yīng)5 d后(30日齡)用于試驗。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計下載Ch-MDA5，Ch-TLR3，Ch-TLR7，MAVS，TRIF和MyD88的基因序列，其GenBank序列號分別為：AB371640、KM486593、KM486601、M-001012893、NM-001030962和NM-001081506。以這些參考基因序列作為引物設(shè)計的模板，使用Primer Premier 5.0設(shè)計多對特異性PCR引物，引物長度在18 bp～22 bp之間，擴(kuò)增產(chǎn)物長度小于300 bp。

1.2.2引物篩選和各基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備用新城疫病毒弱毒疫苗株(La Sota)感染11日齡的SPF雞胚。在病毒感染24 h后收取雞胚尿囊液，應(yīng)用Trizol法提取其總RNA。溶解于20 μL的TE緩沖液。用核酸/蛋白紫外檢測儀測定RNA的純度(OD 260 mm/OD 280 nm=2.0左右為高純度RNA)。使用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

以上述cDNA為模板，分別使用6個基因的多對特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增相應(yīng)的基因片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。選取條帶單一、亮度高而且產(chǎn)物大小與預(yù)期一致的PCR反應(yīng)中使用的引物，作為各基因的優(yōu)化引物，用于后續(xù)試驗。將PCR產(chǎn)物做膠回收，然后與pUC57載體連接。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒的鑒定采用PCR鑒定和序列測定驗證的方法進(jìn)行。測序結(jié)果分別與GenBank中的參考序列進(jìn)行比對。用核酸/蛋白紫外檢測儀測定質(zhì)粒的純度(OD 260 nm/OD 280 nm=1.8左右為高純度DNA)和濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，置于-20 ℃保存。質(zhì)?？截悢?shù)計算公式為：

拷貝數(shù)(拷貝/μL)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度(g/μL)/MW；

MW(g/mol)=質(zhì)粒大小(bp)×660 g/mol·bp。

1.2.3qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化首先使用不同的退火溫度，進(jìn)行上述6個基因的PCR擴(kuò)增，確定各基因擴(kuò)增反應(yīng)共同的最佳退火溫度，從而達(dá)到一次qPCR操作可同時檢測6個基因的目標(biāo)。然后，使用最佳退火溫度及不同的引物濃度進(jìn)行qPCR，優(yōu)化qPCR的引物使用量。將指數(shù)擴(kuò)增期出現(xiàn)最早(即Ct 值最小)、擴(kuò)增曲線最佳(即典型的 S 型曲線)以及擴(kuò)增產(chǎn)物最多(即熒光增量值最高)的qPCR引物濃度，作為最佳引物濃度。試驗使用了上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的熒光定量PCR預(yù)混液(Master Mix)和緩沖液(buffer)，儀器為Roche LightCycler480 Real-time PCR Machine。

1.2.4qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和回歸方程的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是qPCR方法進(jìn)行基因定量檢測的基礎(chǔ)。本研究分別以8個濃度梯度的Ch-MDA5、Ch-TLR3、Ch-TLR7、MAVS、TRIF和MyD88質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用上述優(yōu)化的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行qPCR，繪制反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.2.5特異性試驗qPCR的特異性通過以下兩個方面進(jìn)行驗證：①對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析，單一產(chǎn)物表現(xiàn)為單個熔解曲線峰值；②用建立的qPCR方法擴(kuò)增對照基因，若無擴(kuò)增則表明方法的特異性強(qiáng)。研究中使用的對照基因包括本實驗室制備和保存的多種天然免疫信號通路信號分子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFIT5、Mx、OASL和PKR)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6敏感性試驗將各基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測所建立的qPCR方法的敏感性。

1.2.7重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)試驗：取5個不同濃度梯度的各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)3個重復(fù)同時進(jìn)行qPCR；批間重復(fù)試驗：取5個不同濃度梯度的各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在同一條件下不同時間點重復(fù)進(jìn)行3次qPCR。

1.2.8qPCR方法的應(yīng)用

1.2.8.1動物免疫及外周血淋巴細(xì)胞樣品的采集30日齡的SPF白色來航雞8只，經(jīng)頸部皮下多點注射新城疫油乳劑疫苗各0.3 mL。分別在免疫前和免疫后6、12、24、36 h經(jīng)翅靜脈采集EDTA抗凝血。每次采集4只雞的血液各0.8 mL，并合并為一份樣品(3.2 mL)。血液在采集后2 h內(nèi)使用雞外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)分離試劑盒(TBD，天津)分離淋巴細(xì)胞備用。

1.2.8.2天然免疫相關(guān)基因的檢測 提取雞淋巴細(xì)胞樣品的總RNA(Trizol法)，溶解于20 μL的TE緩沖液。使用隨機(jī)引物及反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ越⒌膓PCR方法檢測Ch-MDA5，Ch-TLR3，Ch-TLR7，MAVS，TRIF和MyD88的基因轉(zhuǎn)錄水平，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。試驗以細(xì)胞肌動蛋白(actin)作為內(nèi)參照基因，其引物序列(表1)來自參考文獻(xiàn)[9]。通過相對定量法(2-△△Ct)分析免疫后不同時間各基因的轉(zhuǎn)錄水平變化[10-11]。

2結(jié)果

2.1引物及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

優(yōu)化的6個基因引物序列及擴(kuò)增片段的長度見表1。各基因的重組質(zhì)粒的測序結(jié)果均與GenBank中的參考序列100%符合。

2.2qPCR體系、循環(huán)參數(shù)及結(jié)果判定

各基因優(yōu)化的qPCR反應(yīng)體系(20 μL)如下：qPCR Master Mix(2 ) 10 μL，qPCR buffer 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水 4 μL。反應(yīng)程序均為：95℃預(yù)變性2.5 min；95℃ 7 s，55 ℃ 10 s，72℃ 15 s擴(kuò)增45個循環(huán);每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光；熔解曲線分析為95℃ 15 s，60 ℃ 50 s，95℃；最后37 ℃ 30 s結(jié)束。

調(diào)整熒光定量PCR的擴(kuò)增基線和閾值設(shè)定，以閾值線不低于正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。在陽性對照(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品)為有效擴(kuò)增，無模板對照(Non-template control,NTC)無擴(kuò)增的前提下，讀取待測樣品的Ct值，進(jìn)行結(jié)果判定：Ct 值大于40 的樣本為陰性結(jié)果；Ct 值小于或等于40的樣本為陽性結(jié)果。

2.3qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

由qPCR的擴(kuò)增曲線(圖1A)可見，各基因在廣泛的濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)為明顯的指數(shù)擴(kuò)增。各基因的qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1B。詳情如下：

對于濃度梯度為7.4×101～108個拷貝的Ch-MDA5基因，其qPCR的Ct值在8.70～31.46之間，回歸方程為y=38.43-3.301x(擴(kuò)增效率為100%)； 濃度梯度為1×102～1×109個拷貝的Ch-TLR3基因，其反應(yīng)的Ct值在9.22～33.06之間，回歸方程：y=40.91-3.449x(擴(kuò)增效率95%)；濃度梯度為1×102～1×109個拷貝的Ch-TLR7基因，qPCR的Ct值在4.67～28.15之間，回歸方程為y=36.03-3.465x(擴(kuò)增效率94%)；濃度梯度為9.2×102～108個拷貝的雞MAVS基因，反應(yīng)的Ct值在9.38～28.55之間，回歸方程為y=38.50-3.219x(擴(kuò)增效率為100%)；濃度梯度為102～109個拷貝的雞TRIF基因，其qPCR的Ct值在7.51～30.65之間，回歸方程為：y=41.45-3.757x(擴(kuò)增效率95%)；1.4×103～109個拷貝的雞MyD88基因，其反應(yīng)的Ct值在7.88～29.03之間，回歸方程為y=39.69-3.494x(擴(kuò)增效率96%)。

2.4特異性試驗結(jié)果

各基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值見表1，其熔解曲線均為單一峰值(圖略)。此外，這6種基因的引物對多種與天然免疫相關(guān)的對照基因均無擴(kuò)增，表明本研究建立的qPCR方法的特異性強(qiáng)。

A.擴(kuò)增曲線(A1-A6)；B.標(biāo)準(zhǔn)曲線(B1-B6)；1. MDA5；2. TLR3；3. TLR7；4. MAVS；5. TRIF；6. MyD88

A.Amplification curves(A1-A6)；B.Standard curves(B1-B6)； 1.MDA5; 2.TLR3; 3.TLR7; 4.MAVS; 5.TRIF; 6.MyD88

圖1qPCR檢測結(jié)果

Fig.1Detection results of qPCR

2.5靈敏度試驗結(jié)果

本研究建立的qPCR方法靈敏度高。當(dāng)使用建立的方法分別擴(kuò)增10個拷貝數(shù)的Ch-MDA5、Ch-TLR3、Ch-TLR7、MAVS、TRIF和MyD88基因時，反應(yīng)的Ct值分別為34.96、37.14、32.19、35.16、37.45和36.12。

2.6重復(fù)性試驗結(jié)果

建立的qPCR方法在批內(nèi)、批間檢測中的Ct值變異系數(shù)均在合理范圍內(nèi)(5%)，表明方法的重復(fù)性好。

2.7qPCR方法的應(yīng)用

用新城疫油乳劑疫苗免疫后，雞外周血淋巴細(xì)胞中6個天然免疫相關(guān)基因的表達(dá)均迅速上調(diào)。以

Ch-TLR3為例，表2顯示了免疫后不同時間該基因及參考基因(Actin)的qPCR檢測的Ct值，并據(jù)此計算得到了Ch-TLR3表達(dá)水平的倍數(shù)變化值?？梢?，在病毒性油乳劑疫苗免疫后6 h，Ch-TLR3的表達(dá)水平較之免疫前提高了139倍，隨后逐漸下降。在免疫后24 h和36 h時，Ch-TLR3的表達(dá)水平仍然比免疫前分別高出17倍和16倍。由圖2可見，Ch-MDA5、Ch-TLR7、TRIF和MyD88的表達(dá)量均在免疫后6 h達(dá)到高峰，與Ch-TLR3類似。與之對比，MAVS基因的高水平表達(dá)持續(xù)到免疫后12 h(圖2)。可見該疫苗在接種后迅速啟動了雞體的天然免疫信號通路的應(yīng)答。

表2　免疫后外周血淋巴細(xì)胞中Ch-TLR3表達(dá)水平的變化

注：表中的Ct值是3次重復(fù)反應(yīng)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;△Ct = Ct (TLR3)-Ct (Actin)；△△Ct = △Ct (xh) - △Ct (0h), 其中x= 6、12、24、36(h) 。

Note:The Ct value in the table is the mean value of three repetitions with the standard deviation;△Ct = Ct (TLR3)-Ct (Actin)；△△Ct = △Ct (xh) - △Ct (0h), x = 6, 12, 24 or 36 hours.

圖2　疫苗免疫后SPF雞天然免疫受體和

3討論

本研究建立了檢測雞天然免疫3種細(xì)胞受體Ch-MDA5、Ch-TLR3和Ch-TLR7及其配體MAVS、TRIF和MyD88基因的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，可用于相應(yīng)基因的絕對(質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線法)或相對定量(內(nèi)參法)檢測。相比檢測單一受體或配體，可以為相應(yīng)的研究提供更加系統(tǒng)和全面的資料。本研究通過引物的篩選和qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，保證了建立的方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測基因的線性濃度范圍廣、重復(fù)性好、操作簡便及省時等優(yōu)點。

應(yīng)用該方法檢測新城疫油乳劑滅活疫苗免疫后雞體天然免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，表明疫苗可有效地激活Ch-MDA5、Ch-TLR3和Ch-TLR7，以及其相應(yīng)的配體MAVS、TRIF和MyD88，從而啟動天然免疫信號通路信號的傳導(dǎo)。本研究僅列舉了所建立的qPCR方法在雞外周血淋巴細(xì)胞中相應(yīng)基因檢測中的應(yīng)用。除此之外，本實驗室還使用建立的qPCR方法測定了經(jīng)疫苗免疫或免疫增強(qiáng)劑刺激后，雞脾臟淋巴細(xì)胞以及雞胚尿囊液樣品中相應(yīng)基因表達(dá)水平的變化(另文發(fā)表)，初步表明所建立的qPCR方法不僅可用于雞外周血淋巴細(xì)胞樣品的檢測，也可用于雞脾臟淋巴細(xì)胞以及雞胚尿囊液樣品的檢測。在后續(xù)的研究中會繼續(xù)積累相關(guān)研究數(shù)據(jù)，從而更客觀的評價所建立的qPCR方法用于多種樣品檢測的實際應(yīng)用效果。

本研究所建立的系列qPCR方法，可用于檢測病毒感染或者疫苗、藥物作用后，雞體固有免疫系統(tǒng)的應(yīng)答變化，從而有助于闡明病毒的致病機(jī)制，在雞用新型疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及抗病毒藥物的研究與開發(fā)中發(fā)揮作用。

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Development and Application of Quantitative PCR Assay for Detection of Three Innate Immunity-related Cellular Receptors and Ligands in Chickens

HUANG Yan-yan1,2，GAO Dan-dan3，XU Chuan-tian1,2， ZHU Man-ling1,2，YANG Shao-hua1,2，HUANG Qing-hua1,2，ZHANG Lin1,2，ZHANG Xiu-mei1,2，WU Jia-qiang1,2

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong,250100,China;2.ShandongKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan,Shandong,250100,China;

3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Tai'anShandong,271018,China)

Abstract:The main purpose of this study is to establish quantitative PCR (qPCR) for the detection of three pattern recognition receptors (chicken Toll-like receptor 3,Toll-like receptor 7,and melanoma differentiation-associated protein 5) and their respective ligands (TRIF,MyD88 and MAVS) in chickens.We designed and screened PCR primers for the 6 genes.Specific PCR products of the genes were utilized to construct recombinant plasmids,which served as template standards to establish standard curves for the assays.The assays developed in this study were sensitive,specific and could stably detect related genes of wide concentration ranges.Further,the assays were applied in the analysis of related gene expression in specific-pathogen-free (SPF) chickens after immunization with oil-emulsion vaccine against Newcastle disease virus.The up-regulations of expression of all 6 genes were peeked at six hours post vaccination, and at the same time,the mRNA level of IFN-β increased to 252 times.This indicated the efficacy of innate immunity signaling after vaccination.In conclusion,the qPCR developed in this study may be applied in viral pathogenesis research,and novel vaccine,immnopotentiator and anti-viral drug development.

Key words:chicken；innate immunity；receptor and ligand;detection;quantitative PCR

文章編號:1007-5038(2016)04-0012-06

中圖分類號:S852.42

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：黃艷艷(1977-)，女，山東肥城人，助理研究員，博士，主要從事動物病毒學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

基金項目：山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室主任基金項目(2015SYSZR04)；十二五國家科技支撐計劃項目(2015BAD12B03)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303033)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-42-Z12)

收稿日期：2015-08-19