欒竹青， 梁麗琨， 龔雪琴， 劉傳林， 由翠榮， 初　洋

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 煙臺(tái) 264005)

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組培條件下乳牛肝菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

欒竹青， 梁麗琨， 龔雪琴， 劉傳林， 由翠榮， 初洋

(煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 煙臺(tái) 264005)

摘要在組織培養(yǎng)條件下，研究不同因素對(duì)乳牛肝菌Suillus bovinus生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，碳源種類(lèi)、最適糖濃度、MS離子濃度和活性炭濃度等因素對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)都具有顯著影響。最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適葡萄糖濃度為20 g/L、離子濃度為1/4MS、活性炭濃度為0.5 g/L、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為0.4～0.6 mg/L NAA，菌絲最高日生長(zhǎng)量可達(dá)2.45 mm。

關(guān)鍵詞乳牛肝菌；組織培養(yǎng)；碳源；MS；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

Study on optimization of Suillus bovinus under tissue culture conditions

LUAN Zhu-qing, LIANG Li-kun, GONG Xue-qin, LIU Chuan-lin, YOU Cui-rong, CHU Yang

(College of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China)

AbstractA tissue culture experiment about the effect of different factors on the growth ofSuillusbovinuswas studied. The result showed that carbon source, carbon concentration, MS concentration, activated carbon concentration and other factors had significant effects on the growth ofSuillusbovinus. The optimal carbon sources are glucose and sucrose, the optimal concentration of glucose is 20 g/L, the optimal MS concentration is 1/4MS, the optimal activated carbon concentration is 0.5 g/L, and the optimal plant growth regulator is 0.4-0.6 mg/L NAA. The highest daily growth of mycelia is 2.45 mm.

KeywordsSuillusbovinus; tissue culture; carbon source; MS; plant growth regulator

乳牛肝菌是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的野生食用菌，常與櫟和松樹(shù)的根形成菌根Mycorrhiza[1]，是一種外生菌根真菌[2]。它的菌絲可以與共生植物的根形成菌套[3]，包裹在根系外。目前，關(guān)于菌根合成的報(bào)道多采用的是人工接種，即向生長(zhǎng)在自然環(huán)境中松樹(shù)、柏樹(shù)等接種與其共生的菌根菌。但是這種接種方法受到許多外界因素的影響，盧麗君等報(bào)道在自然條件下的菌根合成過(guò)程中，生態(tài)、土壤條件及宿主等因素都會(huì)影響菌根的合成[4]。因此會(huì)出現(xiàn)菌根合成率低，菌種易丟失等一系列問(wèn)題。目前雖然在某些種類(lèi)真菌培育上取得了突破，但大部分菌根真菌尚不能人工培育，因此菌根性食用菌的人工馴化技術(shù)的研究尤為迫切[5-8]。欒慶書(shū)等認(rèn)為實(shí)生苗截根接菌及組培苗接菌，雖要求一定的操作技術(shù)，但菌根化效果最高[9]。付紹春等已成功實(shí)現(xiàn)了美味牛肝菌Boletusedulis與馬尾松Pinusmassoninna幼苗在無(wú)菌條件下的菌根合成[10]。采用組培苗進(jìn)行菌根合成試驗(yàn)，不僅可以提高菌根的合成效率，還可以解決雜菌污染以及菌種易丟失等問(wèn)題。

菌根化組培苗的獲得首先需要找到一種合適的共生培養(yǎng)基。欒慶書(shū)等報(bào)道常用的外生菌根培養(yǎng)基有：1)天然培養(yǎng)基PDA和PDAM等；2)半組合培養(yǎng)基HM、MMN、天冬酰胺、CPDA、CMA等；3)組合培養(yǎng)基MRD、PH、MmA及合成培養(yǎng)基[9]。田春杰等也認(rèn)為PDMA和PD培養(yǎng)基是培養(yǎng)外生菌根真菌較適宜的培養(yǎng)基[11]?？偟膩?lái)看培養(yǎng)外生菌根真菌常用的培養(yǎng)基多是經(jīng)過(guò)改良的PDA培養(yǎng)基[12， 13]。但經(jīng)過(guò)改良的PDA培養(yǎng)基并不適合黑赤松試管苗的生長(zhǎng)。而且，成分單一的培養(yǎng)基存在一定的局限性，對(duì)于不同的菌種，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)和濃度對(duì)其影響不同[14]。因此，有必要在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)不同菌種純培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件進(jìn)行探究[15]。

本試驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于采用了組織培養(yǎng)中常用的1/2MS培養(yǎng)基作為乳牛肝菌的基本培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)探究碳源、碳源濃度、離子濃度和其它一些添加劑等因素對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響，試獲得一種在組培條件下最適的乳牛肝菌增殖培養(yǎng)基，為后期乳牛肝菌和黑赤松試管苗的共培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)，并且為組培苗的菌根合成提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌種本試驗(yàn)所用乳牛肝菌是采集于山東省煙臺(tái)市昆崳山，經(jīng)過(guò)分離純化和鑒定后得到的純菌種，于4℃冰箱保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種獲取取活化的固體菌種，切成1 cm見(jiàn)方的小塊，每瓶6塊接種于1/2MS液體培養(yǎng)基中(1/2MS+20 g/L葡萄糖+100 mg/L肌醇+100 mg/L乳蛋白)，靜置1 d后于25℃黑暗條件下，120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。選用直徑約為2 mm菌絲球用于培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。

1.2.2最適碳源及濃度的篩選基本培養(yǎng)基組成為1/2MS+20 g/L葡萄糖+100 mg/L肌醇+100 mg/L乳蛋白+5.5 g/L瓊脂，pH 5.8～6.0。以20 g/L 5種碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖)分別替換基本培養(yǎng)基中的碳源，設(shè)置空白對(duì)照，每組處理5個(gè)重復(fù)，3次平行試驗(yàn)。本試驗(yàn)均采用直徑2 mm的液體菌絲球進(jìn)行接種。23℃暗培養(yǎng)30 d后采用垂直交叉法對(duì)菌絲直徑進(jìn)行定向測(cè)量，并觀察菌落形態(tài)。以菌絲日生長(zhǎng)量為篩選指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

菌絲日生長(zhǎng)量(mm/d)=菌落平均直徑(mm)/培養(yǎng)天數(shù)(d)

篩選出最適碳源后再對(duì)其濃度5、10、15、20、25和30 g/L進(jìn)行篩選。

1.2.3離子濃度的篩選設(shè)置培養(yǎng)基的離子濃度為1/10MS、1/8MS、1/4MS、1/2MS及MS，空白對(duì)照。試驗(yàn)方法同碳源濃度篩選。

1.2.4活性炭濃度的篩選向基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的活性炭0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L，設(shè)空白對(duì)照。方法同上，15 d后進(jìn)行測(cè)量并觀察記錄菌絲密度。

1.2.5植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的篩選采用單因素水平對(duì)照試驗(yàn)，向基本培養(yǎng)基中添加6-BA(6-Benzylaminopurine，6-芐氨基嘌呤)0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L、IBA(3-Indolebutyric acid，3-吲哚丁酸)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L、NAA(α-Naphthaleneacetic Acid，α-萘乙酸)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L，均設(shè)置空白對(duì)照。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，并在α= 0.05水平下進(jìn)行LSD顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1碳源種類(lèi)和濃度對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖1是對(duì)不同碳源篩選的試驗(yàn)結(jié)果，可以看出碳源種類(lèi)對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)存在顯著差異。從試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可以看出乳牛肝菌對(duì)葡萄糖和蔗糖的利用效果最好，二者均可達(dá)到1.80 mm的日生長(zhǎng)量；葡萄糖和蔗糖日生長(zhǎng)量均值分別是麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉處理的1.4倍、3倍和6倍。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，碳源種類(lèi)對(duì)乳牛肝菌菌絲密度的影響差異不大。本試驗(yàn)選用葡萄糖作為后續(xù)試驗(yàn)的最適碳源。

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)乳牛桿菌生長(zhǎng)的影響

圖2是對(duì)最適碳源即葡萄糖濃度進(jìn)行篩選的結(jié)果，可以看出葡萄糖濃度對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)具有顯著影響。葡萄糖水平為20 g/L時(shí)，菌絲的日生長(zhǎng)量為最大值1.86 mm。同時(shí)可以看出，葡萄糖濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于菌絲生長(zhǎng)，葡萄糖濃度過(guò)低則碳源不充足，葡萄糖濃度過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生較高的滲透壓，因此確定最適葡萄糖濃度為20 g/L。

圖2 葡萄糖濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

2.2離子濃度對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖3是對(duì)培養(yǎng)基離子濃度的篩選結(jié)果。由圖3可知MS離子濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)存在顯著差異。培養(yǎng)基離子水平為1/10MS時(shí)，乳牛肝菌菌絲日生長(zhǎng)量達(dá)到最大值2.65 mm；但同時(shí)通過(guò)對(duì)菌絲密度的觀察發(fā)現(xiàn)(圖4)，不同離子濃度下菌絲密度有很大差異，1/4MS、1/2MS和MS水平的菌絲密度基本相同，是1/8MS和1/10MS水平的2倍左右，是對(duì)照組的4倍左右。綜合考慮菌絲生長(zhǎng)速度和菌絲密度兩方面結(jié)果，確定乳牛肝菌的最適離子濃度為1/4MS。

圖3離子濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

圖4 離子濃度對(duì)菌絲密度的影響比較

2.3活性炭濃度對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由于活性炭對(duì)黑赤松試管苗的生根有利，因此本試驗(yàn)需要考慮活性炭對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。從圖5可知活性炭濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)存在顯著影響。1.0 g/L和1.5 g/L的活性炭水平下菌絲日生長(zhǎng)量可達(dá)最大值，分別為3.42 mm和3.41 mm，二者之間差異不顯著。試驗(yàn)證明，活性炭有利于菌絲的迅速擴(kuò)散(15 d左右可長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面)。但通過(guò)對(duì)菌絲密度的觀察發(fā)現(xiàn)，活性炭水平為0 g/L和0.5 g/L時(shí)菌絲最濃密，是1.0 g/L和1.5 g/L水平下的2倍左右，2.0 g/L和2.5 g/L活性炭水平下菌絲最稀疏。從以上兩個(gè)方面考慮，可以初步篩選活性炭的濃度為0.5 g/L。

圖5 活性炭濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

2. 4不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由于IBA和NAA濃度均會(huì)對(duì)黑赤松試管苗的生根產(chǎn)生影響，因此需要考慮這兩個(gè)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。圖6展示了IBA濃度的篩選結(jié)果，可以看出IBA對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

圖6 IBA濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

圖7是對(duì)NAA濃度的篩選結(jié)果，可以看出NAA濃度對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)具有顯著影響。NAA水平為0.4和0.6 mg/L時(shí)，兩者之間的菌絲生長(zhǎng)差異不顯著，菌絲日生長(zhǎng)量都達(dá)到了所有NAA篩選水平中的最大值，約為2.45 mm。

圖7 NAA濃度對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖8為6-BA濃度對(duì)乳牛肝菌的影響結(jié)果，可以看出6-BA濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)具有顯著影響。6-BA濃度為3.0和4.0 mg/L時(shí)菌絲日生長(zhǎng)量達(dá)到最大值2.41 mm。

圖8 6-BA對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖9 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖9是根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果挑選出的對(duì)菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)最大的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的縱向比較，從中可以看出0.4 mg/L IBA水平與其它兩種調(diào)節(jié)劑水平的測(cè)量結(jié)果均達(dá)到顯著差異；0.4 mg/L NAA和3.0 mg/L 6-BA兩個(gè)水平對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響差異不顯著。

3討論

3.1最適碳源及濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明碳源種類(lèi)對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)存在顯著影響，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)乳牛肝菌生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適的葡萄糖濃度為20 g/L。這與Hatakeyama & Ohmasa對(duì)十幾種牛肝菌的營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行研究后得出的結(jié)論基本一致[16]。鄧百萬(wàn)和陳文強(qiáng)通過(guò)對(duì)不同碳源培養(yǎng)基中美味牛肝菌菌絲的生長(zhǎng)狀況、生長(zhǎng)速度及差異顯著性進(jìn)行比較后得出，美味牛肝菌的最適碳源培養(yǎng)基為葡萄糖20 g/L[17]。這可能與葡萄糖是小分子單糖的性質(zhì)有關(guān)，培養(yǎng)基中添加葡萄糖可以直接被乳牛肝菌吸收，提高乳牛肝菌對(duì)碳源的利用率；而適宜濃度的碳源既可以保證菌體得到充足的物質(zhì)和能量供應(yīng)，同時(shí)又可以避免碳源濃度過(guò)高引起的高滲透壓對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)帶來(lái)的負(fù)面影響。

3.2離子濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

Giltrap & Lewis指出外生菌根真菌對(duì)磷酸鹽的需求量較大，但培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度過(guò)高也會(huì)抑制菌根真菌的生長(zhǎng)[18]。Nagarajan & Ntarajan指出適量鈉鹽對(duì)菌根真菌的細(xì)胞質(zhì)代謝有促進(jìn)作用[19]。郭秀珍和畢國(guó)昌認(rèn)為牛肝菌在生長(zhǎng)中需要維生素B1和維生素B2，黃色須腹菌Rhizopogonluteolus在生長(zhǎng)中需要肌醇，土生空?qǐng)F(tuán)菌Cenococcumgeophilum需要維生素H[20]。何華等認(rèn)為菌根菌較適宜在添加有維生素類(lèi)物質(zhì)的天然基質(zhì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如添加B 族維生素[21]。本研究采用組織培養(yǎng)試驗(yàn)中常用的MS母液，其中包含了大量元素、微量元素、維生素和有機(jī)附加物等，可以滿足乳牛肝菌的生長(zhǎng)需要。通過(guò)篩選得到的最適的離子濃度為1/4MS，離子濃度低于此水平會(huì)導(dǎo)致菌絲密度降低，不能滿足菌體對(duì)離子的基本需求；離子濃度過(guò)高則會(huì)形成高滲透壓，同時(shí)一些對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用的離子也會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)形成較大的阻力，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢。

3.3活性炭濃度對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

活性炭是組織培養(yǎng)的常用物質(zhì)，培養(yǎng)基中添加活性炭有利于黑赤松試管苗的生根。它給培養(yǎng)物創(chuàng)造了暗環(huán)境，產(chǎn)生了對(duì)生長(zhǎng)抑制物的吸附作用[22]。本研究的后續(xù)工作是在組織培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)乳牛肝菌與黑赤松試管苗的成功侵染，并進(jìn)一步提高菌根合成率，因此需要考慮活性炭對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響。研究中發(fā)現(xiàn)活性炭可以促進(jìn)乳牛肝菌菌絲的迅速蔓延，目前還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的研究報(bào)道，活性炭促進(jìn)乳牛肝菌菌絲迅速蔓延的機(jī)理尚不明確。但較高濃度的活性炭會(huì)導(dǎo)致菌絲稀疏現(xiàn)象，考慮與活性炭的吸附作用有關(guān)，因此選取的最適的活性炭濃度為0.5 g/L。

3.4不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響

本研究選用的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均對(duì)黑赤松試管苗的生長(zhǎng)有一定影響，IBA可以促進(jìn)植物主根的生長(zhǎng)，提高成活率；NAA可以促進(jìn)生根尤其是不定根的形成；而6-BA則可以促進(jìn)芽的形成，抑制衰老。而在對(duì)IBA、NAA等幾種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑赤松試管苗生根的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NAA可以顯著促進(jìn)黑赤松的側(cè)根形成，使根系發(fā)達(dá)，植株粗壯。

研究發(fā)現(xiàn)3種物質(zhì)對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)有不同程度的影響，其中IBA對(duì)乳牛肝菌的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響；而6-BA對(duì)乳牛肝菌的影響不穩(wěn)定，后期隨著6-BA濃度的升高，乳牛肝菌的日生長(zhǎng)量也會(huì)上升，一定濃度后趨于穩(wěn)定； NAA對(duì)乳牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用則體現(xiàn)在0.4～0.6 mg/L范圍內(nèi)，因此培養(yǎng)基中添加既可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)又利于生根的NAA。陳豫在對(duì)外生菌根真菌鱗柄白毒鵝膏Amanitavirosa與白毒鵝膏Amanitaverna生物學(xué)特性的研究中指出2, 4-D、6-BA 和NAA 對(duì)菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有影響[23]，這與本研究所得的結(jié)論并不一致，考慮可能與菌種類(lèi)別有關(guān)。

劉楊在乳牛肝菌基本培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)中指出， Pach培養(yǎng)基上的菌絲日均生長(zhǎng)量極顯著地高于綜合 PDA和蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基，與 MMN和MM培養(yǎng)基相比日均生長(zhǎng)量的差異也達(dá)到了顯著水平，菌絲日生長(zhǎng)量可達(dá)1.97 mm/d[24]，但此結(jié)果要低于本試驗(yàn)中NAA對(duì)乳牛肝菌的影響結(jié)果。

因此，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的1/2MS培養(yǎng)基可以作為乳牛肝菌的增殖培養(yǎng)基，并且可以用于乳牛肝菌與黑赤松試管苗的共生培養(yǎng)研究中。

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中圖分類(lèi)號(hào)S718.81；S646.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B

文章編號(hào)2095-1736(2016)01-0106-04

作者簡(jiǎn)介：欒竹青，碩士研究生，主要從事應(yīng)用微生物研究；通信作者：由翠榮，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物組織細(xì)胞培養(yǎng)研究，E-mail: ycrytu@163.com。

基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GNC11037)

收稿日期：2015-05-18；修回日期：2015-06-24

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.01.106