齊成龍， 胡藝媛， 王　平， 王　強(qiáng)， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122)

?

酪氨酸酶催化兒茶素接枝絲素蛋白及其抗氧化性研究

齊成龍， 胡藝媛， 王平， 王強(qiáng)， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122)

摘要以兒茶素為天然抗氧化劑，借助于酪氨酸酶的催化氧化作用，將兒茶素與絲素蛋白伯胺基反應(yīng)，進(jìn)行絲織物生物改性加工。以分光光度法考察兒茶素在絲織物表面的吸附/接枝效果，測(cè)定織物色度、紫外防護(hù)因子(UPF)、抗氧化性(DPPH法)及機(jī)械性能變化，評(píng)價(jià)酶促兒茶素與絲素蛋白接枝效果。研究結(jié)果表明，酪氨酸酶能催化兒茶素氧化生成顏色較深的醌類產(chǎn)物；絲織物經(jīng)酶促兒茶素處理后較對(duì)照樣色深增加，UPF增加，機(jī)械性能變化較小；兒茶素處理和酪氨酸酶/兒茶素組合處理均能提高絲織物對(duì)DPPH自由基的清除效果，其中后者具有較好抗氧化耐洗性。

關(guān)鍵詞酪氨酸酶；絲素蛋白；兒茶素；抗氧化性

Enzymatic grafting of catechin onto silk fibroins with tyrosinase and its antioxidant performance

QI Cheng-long, HU Yi-yuan, WANG Ping, WANG Qiang, FAN Xue-rong

( Key Laboratory of Eco-Textiles Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

AbstractEnzymatic modification of silk fibroin was carried out by using tyrosinase and a natural antioxidant of catechin via covalent reaction between catechin and primary amine groups of silk fibroins. Spectrophotometry was used to evaluate the efficacy of adsorption and grafting of catechin onto the fibroin surfaces. The parameters like color depth, UPF value, antioxidant ability (DPPH method) and mechanical behavior for the catechin-treated silk fabrics were investigated, respectively. The results indicated that catechin could be enzymatically oxidized and conversed into dark quinone products. The color depth and UPF value for the treated sample were higher than those of the control, while less strengthen changes were detected before and after enzymatic treatments. Furthermore, both catechin treatment and tyrosinase/catechin treatment improved the antioxidant ability of silk fabrics against DPPH radical, more satisfactory result was achieved for the sample based on the combined treatment with tyrosinase and catechin.

Keywordssilk fabrics; catechin; tyrosinase; antioxidant ability

茶多酚中兒茶素屬黃烷醇類物質(zhì)，是一種還原性多元酚類物質(zhì)，在水溶液中易被空氣氧化，常用作抗氧化劑[1]。兒茶素分子上具有多個(gè)酚羥基，性質(zhì)較活潑，其中苯環(huán)上的一對(duì)鄰酚羥基易氧化形成鄰醌，而鄰醌又較不穩(wěn)定，易發(fā)生復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng)，進(jìn)而形成雙黃烷醇類(Bisflavanols)、茶黃素類(Theaflavins)和茶紅素(Thearubigins)等[2]，兒茶素及其氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素等具有較強(qiáng)抗氧化作用，如可清除超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧、過(guò)氧自由基、羥自由基等。絲素材料具有良好的應(yīng)用特性，如光澤優(yōu)雅、吸濕優(yōu)良、生物相容性好，不僅用作紡織工業(yè)，且在食品、家化和生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域具有廣泛地應(yīng)用和研究[3]。絲素材料改性加工中，具有潛化作用功效的酶有蛋白酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase)、多酚氧化酶(如漆酶、酪氨酸酸酶)等?？紤]到絲素中含有約10%的酪氨酸殘基[4]，這為基于酪氨酸酶催化氧化的絲素改性提供了可能。另一方面，由于絲素蛋白中酪氨酸殘基可及度因絲素材料形態(tài)不同而存在較大差異[5， 6]，至于絲素纖維表面的酪氨酸可能存在的其他反應(yīng)需要更復(fù)雜的技術(shù)證明，因此以酪氨酸酶進(jìn)行酶促絲素改性時(shí)，其催化效率也存在差異[7]。

根據(jù)酪氨酸酶對(duì)多酚化合物具有催化氧化的特性[8]，本文以酪氨酸酶與兒茶素組合處理絲素蛋白，以提高真絲織物的抗氧化性能(圖1)。借助于光譜分析，評(píng)價(jià)酶促催化氧化兒茶素的效果，研究酶促兒茶素氧化產(chǎn)物與絲素蛋白吸附/接枝對(duì)絲織物UPF與抗氧化性的影響。

圖1 酪氨酸酶催化氧化兒茶素及與絲素反應(yīng)機(jī)制

Fig 1 Reaction mechanism of tyrosinase-catalyzed oxidation of catechin and grafting of it onto fibroin

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

真絲織物(90 g/m2)，酪氨酸酶(980 U/mg，美國(guó)Worthington Biochemical Corporation)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，兒茶素(98%純度，上海寶曼生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

SG9溶解氧測(cè)定儀(美國(guó)METTLER TOL)，UV-2808S紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器限公司)，SPX-150C恒溫恒濕箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，Color-eye 7000A測(cè)色配色儀(美國(guó)Macbeth公司)，Cary50紡織品紫外線防護(hù)因子測(cè)定儀(上海羅中紡織科技有限公司)，YG(B)026D型電子織物強(qiáng)力機(jī)(溫州大榮紡織儀器有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶催化氧化兒茶素溶液

以酪氨酸酶催化氧化兒茶素，在pH 7，30℃條件下反應(yīng)0～24 h，其中酪氨酸酶8.43 U/mL、兒茶素40 mg/L。測(cè)定反應(yīng)后溶液吸光度D(λ)，并與未加酶的兒茶素溶液試樣作對(duì)比。為提高酶催化氧化效果，酶促反應(yīng)中體系保持持續(xù)通入氧氣。

將酪氨酸酶加入100 mg/L 兒茶素溶液中，在密封條件下處理30 min(其他條件與上述反應(yīng)相同)，測(cè)定溶解氧濃度。

1.2.2酪氨酸酶促兒茶素處理真絲織物

真絲織物以8.43 U/mL酪氨酸酶、100 mg/L兒茶素在pH 7，30℃條件下處理3 h，浴比1∶100；處理結(jié)束后織物以30℃水清洗2次，室溫晾干，分別考察絲織物表面兒茶素的吸附/接枝率及織物抗氧化性等性能。

1.2.3測(cè)試方法

1)溶解氧濃度

在30℃密封條件下恒溫?cái)嚢?，以SG9溶氧儀測(cè)定不同溶液體系(兒茶素、酪氨酸酶+兒茶素)各時(shí)刻的溶解氧濃度。

2)兒茶素吸附/接枝率

絲織物按照2.2.2述及的方法處理后，測(cè)定反應(yīng)后殘液400 nm處的吸光度，以反應(yīng)后試樣與對(duì)照樣的吸光度變化率，計(jì)算絲素表面兒茶素的吸附/接枝率。

(1)

其中D(λ0)是反應(yīng)后未添加絲素的兒茶素或兒茶素+酶溶液的吸光度，D(λi)為反應(yīng)后含絲素樣品的兒茶素或兒茶素+酶溶液的吸光度。

3)絲素織物色度值

以測(cè)色配色儀測(cè)定不同條件下處理后絲素織物的色度值，記錄試樣最大吸收波長(zhǎng)、色度值L*、a*、b*、C*、H和染色深度K/S。其中，測(cè)色條件為D65標(biāo)準(zhǔn)光源、10°視場(chǎng)。

4)織物紫外防護(hù)因子(UPF)

絲織物試樣折疊3層后，采用紡織品紫外線防護(hù)因子測(cè)定儀測(cè)定不同條件下處理絲織物及空白樣的紫外防護(hù)性，記錄不同樣品的紫外防護(hù)因子(UPF)數(shù)值。

5)織物抗氧化性及耐洗性

以無(wú)水乙醇配制0.1 mM的DPPH醇溶液，不同條件下處理后的絲織物(400 mg)加入10 mL DPPH醇溶液，避光反應(yīng)30 min后立即測(cè)定517 nm處的吸光度，評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果，參照式(2)計(jì)算試樣抗氧化性(Antioxidant activity, AA)[9,10]。

(2)

其中D(λcontrol)是未處理絲織物吸光度；D(λsample)是兒茶素處理織物的吸光度。

為考察織物抗氧化性的耐洗性，處理后的織物試樣在40℃水洗，每次水洗時(shí)間10 min，重復(fù)水洗后測(cè)定干燥后試樣的抗氧性能。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)3塊平行樣的結(jié)果分別計(jì)算不同樣品的UPF值、抗氧化性及其耐洗性。

6)織物機(jī)械性能測(cè)定

織物經(jīng)兒茶素和酪氨酸酶處理后，參照GB/T3923.1-2013測(cè)定經(jīng)向織物斷裂強(qiáng)力與斷裂伸長(zhǎng)，并根據(jù)4塊平行樣的結(jié)果計(jì)算其平均斷裂強(qiáng)度與斷裂延伸度。

2結(jié)果與討論

2.1酶催化氧化兒茶素溶液UV-vis分析

分別測(cè)定兒茶素、酪氨酸酶+兒茶素溶液經(jīng)不同時(shí)間(0、3、6、24 h)處理后殘液的吸光度D(λ)，評(píng)價(jià)酶促氧化效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，圖2(b)是以酪氨酸酶溶液作空白液測(cè)得的吸光度。

圖2 酪氨酸酶催化氧化兒茶素溶液的吸光值

圖2(a)為未添加酪氨酸酶的兒茶素溶液，可見(jiàn)光范圍內(nèi)溶液吸收曲線沒(méi)有明顯變化， 24 h處理后溶液顏色略泛黃，其原因是部分兒茶素被空氣氧化苯環(huán)的共軛體系改變。兒茶素溶液中添加酪氨酸酶后氧化反應(yīng)加快，溶液顏色在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生變化。如圖2(b)所示，氧化后兒茶素溶液吸光值也隨之增加，表明體系中生成了兒茶素氧化產(chǎn)物或小分子多酚聚合物，即兒茶素分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基可被氧化成醌類化合物，或進(jìn)一步氧化成多酚聚合物[10]。為進(jìn)一步研究酶催化氧化兒茶素的反應(yīng)過(guò)程，實(shí)驗(yàn)中考察了密閉條件下兒茶素酶催化氧化效果，測(cè)定體系中溶解氧濃度變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 密閉條件下酪氨酸酶催化氧化兒茶素溶液氧濃度變化

圖3中隨著兒茶素氧化反應(yīng)的進(jìn)行，氧氣消耗加快，溶液中氧濃度越來(lái)越低。加入酪氨酸酶的溶液反應(yīng)初期氧濃度下降的速率更快，驗(yàn)證了酪氨酸酶加快兒茶素的氧化進(jìn)程，隨著氧化反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，體系中溶液顏色加深，氧濃度變化趨緩。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為提高酶催化氧化效果，反應(yīng)體系中采用通入氧氣的方法增加氧濃度。

2.2酶催化氧化兒茶素處理絲織物吸附/接枝效果

以酪氨酸酶催化氧化兒茶素在絲織物表面接枝，測(cè)定在30℃處理3 h后兒茶素、酪氨酸酶和兒茶素處理殘液的吸光值D400 nm，計(jì)算兒茶素及其氧化產(chǎn)物在絲織物表面的吸附/接枝效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 兒茶素及酪氨酸酶處理絲織物的殘液吸光度

圖4中兒茶素空白溶液保溫3 h后溶液吸光度為0.064，添加絲素織物后溶液吸光度下降了59%，其原因與兒茶素在絲素表面吸附相關(guān)。兒茶素分子具有較好的平面性，較易與絲素蛋白分子形成范德華力；兒茶素分子上又有許多酚羥基，能與絲素表面的氨基和羥基形成氫鍵。在兒茶素溶液中加入酪氨酸酶后，兒茶素被催化氧化成有色的醌類物質(zhì)及小分子聚合物，吸光度是空白液的2倍。圖4中絲織物在經(jīng)酪氨酸酶氧化的兒茶素溶液中處理后，殘液吸光度較未添加絲素時(shí)明顯下降，絲素表面兒茶素及其氧化物的吸附/接枝率達(dá)到75%，這與酶促兒茶素氧化生成的產(chǎn)物與絲素中的伯胺基及酪氨酸殘基反應(yīng)相關(guān)[11, 12]，促進(jìn)了其在絲素蛋白表面的接枝。

兒茶素是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的多元酚化合物，兩個(gè)芳環(huán)(A、B環(huán))之間以三碳鏈相連；酶促反應(yīng)形成的兒茶素氧化物中B環(huán)上鄰位-OH被氧化成鄰位C=O，分子平面結(jié)構(gòu)較兒茶素變化小，因此在絲素上不僅吸附性差異較小，而且能與絲素形成共價(jià)鍵合。與兒茶素相比，酪氨酸酶處理后形成的兒茶素氧化物溶液的顏色略深。

2.3酶催化氧化兒茶素處理絲織物色度值

經(jīng)不同條件下兒茶素處理過(guò)后，絲織物外觀色度也不同程度上發(fā)生改變。測(cè)定試樣表面的色度值(L、a、b、C、H)和表面深度K/S，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兒茶素和酪氨酸酶處理后絲織物色度值

表1中未處理絲織物表面明度(L)較高，在兒茶素溶液浸漬和同時(shí)添加酪氨酸酶處理3 h后明度下降，織物的黃度(b)、染色深度(K/S)增加趨勢(shì)一致，相比于未處理的b、K/S，兒茶素浸漬和加酶的樣品的值分別增加3倍和8倍，且隨著織物反應(yīng)溶液中時(shí)間延長(zhǎng)織物表面顏色加深明顯。其原因與兒茶素在空氣中被逐漸氧化相關(guān)，氧化產(chǎn)物部分吸附在纖維表面，使織物表面深度增加。酪氨酸酶處理加速了兒茶素的氧化，經(jīng)不同時(shí)間處理后織物表面明度下降趨多，黃度值有較大增加，表面兒茶素氧化產(chǎn)物在纖維表面發(fā)生有效吸附及接枝。

2.4酶催化氧化兒茶素處理絲織物的紫外防護(hù)因子及抗氧化性

兒茶素屬于天然多酚類化合物，具有一定的抗氧化性，實(shí)驗(yàn)中分別考察了不同條件下處理后織物的抗紫外性及對(duì)DPPH自由基的清除效果，結(jié)果見(jiàn)圖5。由于絲織物本身克重較低，圖5中未經(jīng)整理的空白樣UPF值也較小；經(jīng)兒茶素浸漬與浸漬后同時(shí)用酶處理3 h后的織物UPF值的增幅達(dá)300%和500%，并隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，絲織物的抗紫外效果加強(qiáng)，但只用酶處理的絲素的UPF值與未處理的一樣；兒茶素溶液中添加酪氨酸酶后，溶液中兒茶素氧化產(chǎn)物或分子聚合物增加，其中的苯環(huán)及碳碳雙鍵的共軛體系增加了分子吸收紫外線的能力，因此吸附/接枝到絲纖維表面后，試樣的UPF值明顯增加。

圖5 兒茶素和酪氨酸酶處理后絲織物紫外防護(hù)因子及抗氧化性

具有抗氧化性的織物能抑制或清除具有反應(yīng)性的有害自由基(如活性氧自由基等)，實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)了兒茶素和酪氨酸酶處理后的織物抗氧化性。圖5中未處理織物基本不具有對(duì)DPPH自由基的捕獲能力，抗氧化性較低；經(jīng)兒茶素、兒茶素和酪氨酸酶組合處理后，試樣的抗氧化性有明顯提高，其原因與兒茶素結(jié)構(gòu)中含有的部分酚羥基作為供電基起到捕獲DPPH自由基的作用相關(guān)[10]，與抗紫外一樣，僅用酪氨酸酶處理的絲素織物的抗氧化性也未改變。此外，實(shí)驗(yàn)中延長(zhǎng)浸漬時(shí)間或添加酪氨酸酶時(shí)，雖然兒茶素及其氧化物的吸附/接枝率增加，圖5中試樣抗氧化性增加不明顯，其原因可能是處理中兒茶素結(jié)構(gòu)內(nèi)更多酚羥基被酪氨酸酶氧化成醌類結(jié)構(gòu)，因此試樣抗氧化性增加較少[13]。

兒茶素和氧化兒茶素在絲素蛋白上均有非特異性吸附功能，為評(píng)價(jià)絲織物抗氧化性的耐洗性，實(shí)驗(yàn)中考察了兒茶素、兒茶素和酶組合處理試樣經(jīng)不同次數(shù)水洗后對(duì)DPPH自由基的清除效果，計(jì)算抗氧化性結(jié)果見(jiàn)圖6。

兒茶素與酶組合后絲織物表面的兒茶素及其氧化物吸附/接枝率較高，但圖6中水洗前兩者對(duì)DPPH自由基清除效果相近，其原因與試樣上未被氧化的兒茶素含量相關(guān)。經(jīng)不同次數(shù)水洗后，兒茶素處理樣和與酶/兒茶素組合處理織物的抗氧化性下降程度超過(guò)60%，其原因是試樣表面吸附的兒茶素及兒茶素氧化產(chǎn)物在水洗中部分去除。經(jīng)6次水洗后兒茶素與酪氨酸酶組合處理樣的抗氧化性較高，驗(yàn)證了處理中兒茶素部分以吸附結(jié)合外，還有部分是通過(guò)接枝方式與織物結(jié)合。因此，酶促絲織物改性后絲纖維表面結(jié)合的兒茶素及其氧化物總量較多，處理后織物不但吸附/接枝率較高，試樣抗氧化性的耐洗性也優(yōu)于僅兒茶素處理樣。

圖6 兒茶素和酪氨酸酶處理絲織物抗氧化的耐洗性

2.5酶催化氧化兒茶素處理絲織物的物理機(jī)械性能

酪氨酸酶不但可催化氧化兒茶素在絲織物表面接枝，也對(duì)絲素蛋白中酪氨酸殘基具有作用。實(shí)驗(yàn)中考察了不同條件下處理后試樣的斷裂強(qiáng)力和斷裂延伸度，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 兒茶素和酪氨酸酶處理絲織物的斷裂強(qiáng)力與延伸度

與未處理的絲織物空白樣相比，酪氨酸和兒茶素組合處理對(duì)織物的斷裂強(qiáng)度和斷裂延伸度影響較小，斷裂強(qiáng)力和斷裂延伸度分別都在145 N和23%左右，表明兒茶素及其氧化物吸附和酶促氧化過(guò)程對(duì)纖維機(jī)械性能影響較小。

3結(jié)論

1)酪氨酸酶能催化氧化具有酚羥基結(jié)構(gòu)的兒茶素，在30℃和pH 7條件下隨著氧化處理時(shí)間延長(zhǎng)，生成顏色較深的醌類化合物及低分子聚合物，絲織物經(jīng)兒茶素、兒茶素和酪氨酸酶組合處理后表面深度增加。

2)兒茶素不但能吸附在纖維表面，在酪氨酸酶催化氧化下能與絲素蛋白發(fā)生接枝，使織物的紫外防護(hù)因子UPF和對(duì)DPPH自由基清除能力增加；與兒茶素吸附樣相比，兒茶素與酶組合處理樣的抗氧化性的紫外防護(hù)性較高、抗氧化性相近，且后者的抗氧化的耐洗性由于兒茶素吸附樣；兒茶素在絲素表面吸附及酶促接枝對(duì)絲素纖維物理機(jī)械性能影響較小。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yamamoto Y, Gaynor R B. Therapeutic potential of inhibition of the NF-κB pathway in the treatment of inflammation and cancer [J]. Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(2):135-142.

[3]Hertog M G, Feskens E J, Kromhout D, et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study [J]. Lancet, 1993, 324(8878):1007-1011.

[4]Wang P, Yu M L, Cui L, et al. Modification ofBombyxmorisilk fabrics by tyrosinase-catalyzed grafting of chitosan[J]. Engineering in Life Sciences, 2014, 14(2): 211-217.

[5]Kundu S C, Dash B C, Dash R, et al. Natural protective glue protein, sericin bioengineered by silkworms: Potential for biomedical and biotechnological applications[J]. Progress in Polymer Science, 2008, 33(10): 998-1012.

[6]Cheung H Y, Ho M P, Lau K T, et al. Natural fibre-reinforced composites for bioengineering and environmental engineering applications[J]. Composites Part B: Engineering, 2009, 40(7):655-663.

[7]Freddi G, Anghileri A, Sampaio S, et al. Tyrosinase-catalyzed modification ofBombyxmorisilk fibroin: Grafting of chitosan under heterogeneous reaction conditions [J]. Journal of Biotechnology, 2008, 125(2): 281-294.

[8]Kang G D, Lee K H, Ki C S, et al. Crosslinking reaction of phenolic side chains in silk fibroin by tyrosinase[J]. Fibers and Polymers, 2004, 5(3):234-238.

[9]Luo W, Zhao M M, Yang B, et al. Identification of bioactive compounds inPhyllenthusemblicaL.fruit and their free radical scavenging activities[J].Food Chemistry, 2009, 114(2):499-504.

[10]Sousa F, Guebitz G M, Kokol V, et al. Antimicrobial and antioxidant properties of chitosan enzymatically functionalized with flavonoids [J]. Process Biochemistry, 2009, 44(7): 749-756.

[11]Jus S, Kokol V, G ebitz G M, et al. Tyrosinase-catalysed coupling of functional molecules onto protein fibres[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2008, 42(7):535-542.

[12]張勇. 多酚氧化酶模型化合物的合成、表征及反應(yīng)性研究[D]: 武漢: 華中師范大學(xué), 2006.

[13]Osman A M. Multiple pathways of the reaction of 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH·) with (+)-catechin: evidence for the formation of a covalent adduct between DPPH· and the oxidized form of the polyphenol[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 412(3):473-478.

中圖分類號(hào)TS195.19

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)02-0049-05

作者簡(jiǎn)介：齊成龍，碩士研究生，從事紡織品生態(tài)染整加工技術(shù)研究，E-mail:qichenglong2014@163.com；通信作者：王 平，教授，從事紡織品生態(tài)染整加工技術(shù)研究，E-mail:wxwping@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(51373071)

收稿日期：2015-05-14；修回日期：2015-06-12

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.0049