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金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)生物大分子含量變化的光鑷?yán)庾V研究*

0引言

【研究意義】金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌，是臨床上重要的病原菌，是引起臨床感染及手術(shù)切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染[1]。它在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于外部環(huán)境的不斷變化，細(xì)菌細(xì)胞必需實(shí)時(shí)對(duì)環(huán)境信號(hào)的刺激作出響應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的改變，細(xì)胞內(nèi)生物大分子組成及含量的變化。金葡菌的代謝狀態(tài)對(duì)其耐藥性以及對(duì)宿主的毒力作用均有重要影響。因此，深入了解金葡菌生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)生物大分子的變化對(duì)理解其致毒機(jī)理以及感染的預(yù)防和治療具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物樣品中的主要成分(核酸、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、碳水化合物)可以對(duì)入射光進(jìn)行非彈性散射，產(chǎn)生特征性的拉曼光譜。一個(gè)生物樣品的拉曼光譜包含上千個(gè)像素點(diǎn)，可以同時(shí)涵蓋多種物質(zhì)成分的信息[2]；另外，由于每種物質(zhì)的特征峰強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成正比，所以拉曼光譜可以同時(shí)反映細(xì)胞中多種生物大分子含量的動(dòng)態(tài)變化情況。由于拉曼光譜技術(shù)在靈敏度、分辨率、無(wú)損傷等方面具有的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)日益在細(xì)胞生物學(xué)[3]、微生物學(xué)[4]、醫(yī)學(xué)診斷[5-6]，藥物研究[7]等領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。光鑷?yán)庾V技術(shù)(Laser Tweezer Raman Spectroscopy,LTRS)將光鑷技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)結(jié)合起來(lái)，其原理是利用高度匯聚的激光束，囚禁溶液中的活細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)分子的拉曼散射[8-9]。該技術(shù)充分結(jié)合了共焦顯微、光鑷、拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn),進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究微生物與環(huán)境相互作用過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)生物大分子變化特點(diǎn)的傳統(tǒng)方法，是對(duì)收集的大量微生物樣本破碎細(xì)胞后分別提取核酸、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等成分，再對(duì)每種成分分別定量[10-11]。這種方法樣本需求量大，處理過(guò)程復(fù)雜，而且無(wú)法獲得單細(xì)胞水平生物分子動(dòng)態(tài)變化的信息。因此，本研究擬利用LTRS技術(shù)表征金葡菌分批培養(yǎng)各階段的代謝狀態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)監(jiān)測(cè)并分析金葡菌在不同時(shí)間點(diǎn)拉曼光譜特征峰的變化，獲知細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)不同生物大分子的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1材料與方法

1.1菌種

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加15 g/L瓊脂粉。各培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)及樣品制備

挑取LB固體培養(yǎng)基上的金葡菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，以10%比例轉(zhuǎn)接于含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)31.5 h。分別于1.5 h，3.0 h，4.5 h，6.0 h，7.5 h，9.0 h，10.5 h，13.5 h，16.5 h，19.5 h，22.5 h，25.5 h，28.5 h和31.5 h取1 mL菌液用于測(cè)定菌體密度和拉曼光譜。

菌體密度的測(cè)定方法：將菌液用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋后測(cè)量600 nm處的吸光度OD600。用于拉曼光譜測(cè)定的菌液先經(jīng)過(guò)5 000 r/min離心5 min后，以PBS洗滌2次，然后按照10 μL菌液稀釋為1 mL待測(cè)樣品的比例以PBS稀釋?zhuān)尤?.1%(V/V) Tween 80 渦旋振蕩1 min以制備單細(xì)胞懸液。

1.4光譜收集及數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所用的光鑷?yán)庾V系統(tǒng)按照文獻(xiàn)[10-11]所述方法建立。將細(xì)菌懸液置于樣品槽內(nèi)，100×油浸物鏡下光鑷隨機(jī)俘獲單個(gè)細(xì)胞，將目標(biāo)細(xì)胞提升至石英片上方5 μm左右，激光強(qiáng)度調(diào)整為45 mW，信號(hào)累積時(shí)間為30 s，收集目標(biāo)細(xì)胞的拉曼光譜。此時(shí)收集的光譜是帶有背景的細(xì)胞拉曼光譜。再于細(xì)胞附近以相同條件收集背景拉曼光譜，每個(gè)樣品收集30個(gè)單細(xì)胞的拉曼光譜，3個(gè)背景光譜。

光譜的預(yù)處理采用Matlab 7.0 編寫(xiě)的程序進(jìn)行，每個(gè)細(xì)胞的原始光譜分別經(jīng)過(guò)背景扣除，5點(diǎn)Savitzky-Golay平滑，基線校正，得到細(xì)胞的實(shí)際光譜。光譜圖的繪制及光譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在軟件Origin 8.5中進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)曲線

由金葡菌ATCC 6538生長(zhǎng)曲線(圖1)可知，0～1.5 h為延滯期，1.5～9 h為對(duì)數(shù)期，9 h到培養(yǎng)終點(diǎn)均為穩(wěn)定期。

2.2拉曼光譜

分別選取延滯期(1.5 h)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3.5 h)和穩(wěn)定期(19.5 h)金葡菌拉曼光譜的平均光譜(30個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞光譜的平均)，進(jìn)行特征峰的歸屬指認(rèn)(表1)及不同生長(zhǎng)階段拉曼光譜差別的比較(圖2)。由圖2可以看到，不同生長(zhǎng)階段金葡菌的拉曼光譜差別明顯，例如，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，667 cm-1，724 cm-1，1 001 cm-1，1 574 cm-1以及1 662 cm-1等特征峰強(qiáng)度都有不同程度的變化。

圖1金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線

Fig.1Growth curve of Staphylococcus aureus

表1金黃色葡萄球菌拉曼光譜主要特征峰歸屬[12-13]

Table 1Assignment of the major Raman bands of Staphylococcus aureus cells

峰位置Peakposition(cm-1)峰歸屬Peakasignment(cm-1)667鳥(niǎo)嘌呤環(huán)呼吸振動(dòng)Gringbr.724腺嘌呤Adenine781DNAO-P-O伸縮振動(dòng);U、C、T環(huán)呼吸振動(dòng)DNAO-P-Ostr.;U,C,Tringbr.809RNAO-P-O伸縮振動(dòng)RNAO-P-Ostr.850酪氨酸Tyr1001苯丙氨酸苯環(huán)呼吸峰Pheringbr.1094DNAO-P-O伸縮振動(dòng)DNAO-P-Ostr.1244A,UNH2環(huán)模A,UNH2ringmode1451蛋白質(zhì)/脂類(lèi)CH變形,CH2彎曲振動(dòng)protein/lipidCHdef,CH2banding1574腺嘌呤,鳥(niǎo)嘌呤環(huán)模A,Gringmode1652蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶proteinamideⅠband

圖2不同生長(zhǎng)階段金黃色葡萄球菌細(xì)胞的拉曼光譜

Fig.2Raman spectra of Staphylococcus aureuscells during various growth stages

2.3拉曼光譜特征峰的動(dòng)態(tài)變化

細(xì)胞內(nèi)每種生物大分子的不同基團(tuán)都可能產(chǎn)生拉曼散射，且散射強(qiáng)度與激發(fā)區(qū)域內(nèi)物質(zhì)分子的含量成正比，因此不同特征峰強(qiáng)度的時(shí)間依賴(lài)性變化曲線(圖3)可以追蹤細(xì)胞內(nèi)主要生物分子含量的動(dòng)態(tài)變化情況，提供細(xì)胞代謝狀態(tài)的實(shí)時(shí)信息。按照不同特征峰的歸屬類(lèi)別(核酸或蛋白質(zhì))以及曲線的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)可以將曲線分成2組，A組歸屬于核酸(圖3a)，而B(niǎo)組則是來(lái)源于蛋白質(zhì)(圖3b)的特征峰?？傮w而言，源于核酸的拉曼光譜峰強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移持續(xù)下降(A組)，在延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(1.5～9 h)下降尤其劇烈，其中下降最明顯的3個(gè)峰724 cm-1峰，781 cm-1峰和809 cm-1峰在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將近結(jié)束時(shí)(9 h)的峰強(qiáng)度降低為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期起始時(shí)(1.5 h)強(qiáng)度的1/2。這是由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，絕大多數(shù)細(xì)胞處于細(xì)胞分裂狀態(tài)，DNA復(fù)制活躍，DNA含量加倍，而穩(wěn)定期細(xì)胞大多處于靜止?fàn)顟B(tài)，DNA含量?jī)H相當(dāng)于復(fù)制期的一半。歸屬于蛋白質(zhì)的特征峰強(qiáng)度(B組，850 cm-1峰，1 001 cm-1峰和1 662 cm-1峰)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顯著增強(qiáng)，而到穩(wěn)定期峰強(qiáng)度基本維持恒定，其中，1 001 cm-1峰來(lái)源于蛋白質(zhì)苯丙氨酸殘基，峰形尖銳，基本對(duì)稱(chēng)，周?chē)鷽](méi)有其他物質(zhì)峰的干擾，是反映樣品內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化靈敏的標(biāo)志。蛋白質(zhì)含量隨生長(zhǎng)時(shí)間而增加可能是細(xì)菌細(xì)胞對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分的消耗脅迫所作的響應(yīng)，這種現(xiàn)象在其他細(xì)菌中也可以見(jiàn)到[14]。

圖3金黃色葡萄球菌拉曼光譜各特征峰強(qiáng)度的時(shí)間依賴(lài)性變化

Fig.3Time dependant changes in the band intensities of Raman spectra of Staphylococcus aureus cells

以上結(jié)果表明，光鑷?yán)庾V技術(shù)能實(shí)時(shí)追蹤微生物培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞代謝狀態(tài)的變化。與傳統(tǒng)的檢測(cè)手段相比，基于拉曼光譜的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)樣品需求量小，10 μL或更少體積的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后就可以滿(mǎn)足測(cè)定需要；(2)樣品處理簡(jiǎn)單，可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；(3)可以同時(shí)對(duì)樣品中的多種組分進(jìn)行定量分析，對(duì)于每種組分，光譜中可以有多個(gè)特征峰與之對(duì)應(yīng)，定量結(jié)果相互驗(yàn)證，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可靠性；(4)作為一種單細(xì)胞分析手段，可以提供群體中細(xì)胞間異質(zhì)性的信息。

3結(jié)論

本文研究金黃色葡萄球菌分批生長(zhǎng)時(shí)拉曼光譜特征峰的時(shí)間依賴(lài)性變化特點(diǎn)。結(jié)果顯示，歸屬于核酸的特征峰，如667 cm-1峰，724 cm-1峰，781 cm-1峰，809 cm-1峰和1 574 cm-1峰隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)降低，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期下降幅度尤其劇烈，反映了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的快速分裂和DNA的活躍復(fù)制；同時(shí)，與蛋白質(zhì)相關(guān)的特征峰，如850 cm-1峰，1 001 cm-1峰和1 662 cm-1峰，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顯著增強(qiáng)，而到穩(wěn)定期峰強(qiáng)度基本維持恒定，體現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗所作的響應(yīng)。這表明光鑷?yán)庾V技術(shù)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物細(xì)胞內(nèi)生物大分子的動(dòng)態(tài)變化，獲取有關(guān)代謝狀態(tài)的相關(guān)信息，與傳統(tǒng)分析手段相比，具有單細(xì)胞無(wú)損分析、提供信息豐富、樣本需求量小、高效可靠等優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]KENNY J G,WARD D,JOSEFSSON E,et al.The Sta-

phylococcus aureus response to unsaturated long chain free fatty acids:Survival mechanisms and virulence implications[J].PloS One,2009,4(2):e4344.

[2]SCHUSTER K C,REESE I,URLAUB E,et al.Multidimensional information on the chemical composition of single bacterial cells by confocal Raman microspectroscopy [J].Analytical Chemistry,2000,72(22):5529-5534.

[3]PASCUT F C,KAlRA S,GEORGE V,et al.Non-invasive label-free monitoring the cardiac differentiation of human embryonic stem cells in-vitro by Raman spectroscopy [J].Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects,2013,1830(6):3517-3524.

[4]CHIU Y F,HUANG C K,SHIGETO S.In vivo probing of the temperature responses of intracellular biomolecules in yeast cells by label-free Raman microspectroscopy [J].Chembiochem,2013,14(8):1001-1005.

[5]LI Z F,CHEN Y,LI Y Z,et al.Raman microspectroscopy as a diagnostic tool to study single living nasopharyngeal carcinoma cell lines [J].Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire,2013,91(3):182-186.

[6]BARMAN I,DINGARI N C,SAHA A,et al.Application of Raman spectroscopy to identify microcalcifications and underlying breast lesions at stereotactic core needle biopsy [J].Cancer Research,2013,73(11):3206-3215.

[7]LIY T,QU L L,LID W,et al.Rapid and sensitive in-situ detection of polar antibiotics in water using a disposable Ag-graphene sensor based on electrophoretic preconcentration and surface-enhanced Raman spectroscopy[J].Biosensors & Bioelectronics,2013,43:94-100.

[8]XIE C G,LI Y Q.Cohfocal micro-Raman spectroscopy of single biological cells using optical trapping and shifted excitation difference techniques[J].Journal of Applied Physics,2003,93(5):2982-2986.

[9]XIE C G,DINNO M A,LI Y Q.Near-infrared Raman spectroscopy of single optically trapped biological cells[J].Optics Letters,2002,27(4):249-251.

[10]RESCH A,ROSENSTEIN R,NERZ C,et al.Differential gene expression profiling of Staphylococcus aureus cultivated under biofilm and planktonic conditions[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(5):2663-2676.

[11]PELZ A,WIELAND K P,PUTZBACH K,et al.Structure and biosynthesis of staphyloxanthin from Staphylococcus aureus[J].The Journal of Biological Chemistry,2005,280(37):32493-32498.

[12]MOVASAAGHI Z,REHMAN S,REHMAN I U.Raman spectroscopy of biological tissues [J].Applied Spectroscopy Reviews,2007,42(5):493-541.

[13]NOTINGHER I,VERRIER S,HAQUE S,et al.Spectroscopic study of Human lung epithelial cells (A549) in culture:Living cells versus dead cells[J].Biopolymers,2003,72(4):230-240.

[14]CHUNG H J,BANG W,DRAKE M A.Stress respon-

se of Escherichia coli[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2006,5(3):52-64.

(責(zé)任編輯：尹闖)

Study on Bio-Macromolecular Level Changes in Staphylococcus aureus Cells during Batch Cultivation Using Laser Tweezers Raman Spectroscopy

陶站華1，孫美娟2

TAO Zhanhua1,SUN Meijuan2

(1.廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007；2.百色學(xué)院物理與電信工程系，廣西百色533000)

(1.Laboratory of Biophysics of Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China; 2.Department of Physics and Telecommunication Engineering of Baise University,Baise,Guangxi,533000,China)

摘要：【目的】利用光鑷?yán)庾V技術(shù)(Laser Tweezers Raman Spectroscopy,LTRS)研究金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)胞內(nèi)主要生物大分子含量的動(dòng)態(tài)變化，探尋監(jiān)測(cè)微生物代謝狀態(tài)變化的有效工具。【方法】收集分批培養(yǎng)過(guò)程不同時(shí)間點(diǎn)金黃色葡萄球菌細(xì)胞的拉曼光譜，觀察其特征峰依賴(lài)時(shí)間的變化特點(diǎn)?！窘Y(jié)果】歸屬于核酸的特征峰，如667 cm(-1)峰，724 cm(-1)峰，781 cm(-1)峰，809 cm(-1)峰和1 574 cm(-1)峰在整個(gè)分批生長(zhǎng)階段持續(xù)降低，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期下降幅度尤其劇烈，反映了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂快速，DNA復(fù)制活躍；與蛋白質(zhì)相關(guān)的特征峰，如850 cm(-1)峰，1 001 cm(-1)峰和1 662 cm(-1)峰，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期顯著增強(qiáng)，而到穩(wěn)定期峰強(qiáng)度基本維持恒定。【結(jié)論】光鑷?yán)庾V技術(shù)能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物樣品內(nèi)生物大分子的含量，是單細(xì)胞水平上研究微生物代謝狀態(tài)變化的有效工具。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌拉曼光譜激光鑷子單細(xì)胞分析

Abstract:【Objective】The dynamic change in content of major biological molecules inside Staphylococcus aureus cells in batch cultivation was investigated using laser tweezers Raman spectroscopy.【Methods】Raman spectra of Staphylococcus aureus cells sampled at various time points of batch cultivation were recorded to observe time-dependent changes of the characteristic peaks.【Results】The intensities of characteristic bands at 667 cm(-1),724 cm(-1),781 cm(-1),809 cm(-1) and 1 574 cm(-1),assigned to nucleic acids,decreased continuously throughout the batch growth,and the intensities of these bands dropped even more drastically,especially during the exponential growth phase,which could be attributed to the rapid cell division and active DNA replication in the exponential growth stage.In the meantime,the intensities of Raman peaks around 850 cm(-1),1 001 cm(-1) and 1 662 cm(-1),associated with proteins,increased significantly during the exponential growth phase,and then remained relatively constant during the stationary phase.【Conclusion】The experimental results show that laser tweezers Raman spectroscopy can monitor the content of bio-macromolecules in real time and serve as an efficient tool for analyzing the changes in metabolic states of microorganisms at single cell level.

Key words:Staphylococcus aureus,Raman spectroscopy,laser tweezers,single cell analysis

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.37

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-9164(2016)01-0031-04

作者簡(jiǎn)介：陶站華(1971-)，男，副研究員，主要從事生物光譜學(xué)研究。

收稿日期：2015-09-25

*廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118193)和廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(15YJ22SL08)資助。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):31～34

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-15

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