吳學(xué)元，郝崔培，郭池華，馬 巍

（1.陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西西安 710068；2.陜西省人民醫(yī)院婦科，陜西西安 710068；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710061）

ADM及β－catenin在人骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義

吳學(xué)元1，郝崔培2，郭池華3，馬 巍3

（1.陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西西安 710068；2.陜西省人民醫(yī)院婦科，陜西西安 710068；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，陜西西安 710061）

目的 探討腎上腺髓質(zhì)素（ADM）及β－catenin在人不同分化程度骨肉瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法

采用免疫組化方法檢測33例不同病理分級人骨肉瘤組織（高分化14例，低分化19例）及10例骨軟骨瘤組織石蠟切片中的ADM、總β－catenin（T－β－catenin）及磷酸化β－catenin蛋白（P－β－catenin）的表達(dá)。結(jié)果 ADM在骨肉瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在高、低分化骨肉瘤表達(dá)陽性率分別為57.1％（8/14）和100％（19/19），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003＜0.05）。在高分化骨肉瘤中，T－β－catenin在胞質(zhì)胞核中均有表達(dá)，陽性表達(dá)率為85.7％（12/14）；而在低分化骨肉瘤中，T－β－catenin僅在胞膜上胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)，陽性表達(dá)率為94.7％（18/19）；T－β－catenin在不同惡性程度骨肉瘤中陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.561＞0.05）。P－β－catenin在骨肉瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在高、低分化骨肉瘤中表達(dá)陽性率分別為35.7％（5/14）和78.9％（15/19），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.029＜0.05）。ADM與P－β－catenin（r＝0.424，P＝0.025＜0.05）之間有相關(guān)性，ADM與T－β－catenin（P＝0.078＞0.05）、T－β－catenin與P－β－catenin（P＝0.052＞0.05）之間均無顯著相關(guān)性。結(jié)論 ADM、P－β－catenin蛋白表達(dá)量的高低以及總β－catenin在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)差異可作為判斷骨肉瘤組織惡性程度的重要指標(biāo)。其為進(jìn)一步研究ADM與β－catenin在骨肉瘤的關(guān)系及對骨肉瘤細(xì)胞分化的作用提供了理論依據(jù)。

腎上腺髓質(zhì)素（ADM）；β－catenin；骨肉瘤；分化

骨肉瘤是一種多發(fā)于10～20歲年齡段骨生長旺盛的兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤，這提示骨肉瘤的發(fā)生可能與骨快速生長有關(guān)［1］。由于骨肉瘤侵襲性生長的特點(diǎn)，其復(fù)發(fā)和微轉(zhuǎn)移率高達(dá)80％～90％；未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的5年存活率可達(dá)60％～70％，但一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差，存活率僅30％左右［2］。因此，尋找降低骨肉瘤惡性程度的新方法以延長患者生存期，具有重要的研究及臨床應(yīng)用意義。

近年來，很多學(xué)者從骨肉瘤的細(xì)胞學(xué)起源及相關(guān)基因調(diào)控方面研究骨肉瘤生成的機(jī)制，認(rèn)為骨肉瘤是一種由于內(nèi)源性基因異常導(dǎo)致的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成熟骨細(xì)胞分化過程中受阻而引起的分化缺陷性疾?。?－4］。Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨形成中起著重要的調(diào)控作用，而該通路重要的調(diào)節(jié)因子β－catenin的異常表達(dá)被認(rèn)為與骨肉瘤的形成、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。許多作者應(yīng)用免疫組化證實(shí)β－catenin在骨肉瘤中高表達(dá)，可作為判斷骨肉瘤預(yù)后的一個重要指標(biāo)。然而失活狀態(tài)β－catenin即磷酸化β－catenin（P－β－catenin）在骨肉瘤中的表達(dá)情況卻鮮有研究。同時，骨肉瘤中的總βcatenin（T－β－catenin）及P－β－catenin在不同分化程度的表達(dá)高低及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布也鮮有研究。

腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM）是一種具有多種功能的多肽，具有促進(jìn)腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等作用［6－7］。已證實(shí)在人骨肉瘤組織中ADM呈陽性表達(dá)，并與骨肉瘤分期和臨床預(yù)后有關(guān)［8］。在骨分化過程中，ADM通過誘導(dǎo)P－GSK3β而參與Wnt/β－catenin通路［9］。而ADM、β－catenin在不同分化程度骨肉瘤中的表達(dá)及相關(guān)性，國內(nèi)外尚無報道。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法檢測不同惡性程度的骨肉瘤中ADM、T－β－catenin及P－βcatenin蛋白的表達(dá)情況，并對3者在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，研究影響骨肉瘤分化程度的相關(guān)因素，為尋找有效誘導(dǎo)骨肉瘤的終末分化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院骨科2007年1月至2012年12月骨科手術(shù)切除的標(biāo)本，共33例，為臨床、影像學(xué)及病理3者相結(jié)合確診的骨肉瘤標(biāo)本，其中男19例，女14例。年齡9 ～56歲，平均為20.6歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為骨肉瘤，患者術(shù)前均未行放、化療。根據(jù)組織學(xué)分型，可分為骨母細(xì)胞型8例、纖維母細(xì)胞型12例、軟骨母細(xì)胞型6例、其他類型（血管型、混合型）7例。根據(jù)Enneking分級系統(tǒng)，將骨肉瘤分為低度惡性14例，高度惡性19例。選取同期的骨軟骨瘤標(biāo)本10例作為對照。

1.2 標(biāo)本處理及免疫組化法檢測ADM和β－catenin表達(dá) 骨肉瘤及骨軟骨瘤標(biāo)本經(jīng)100mL/L甲醛水溶液固定，石蠟包埋，切成4μm厚組織切片，附于玻片上，采用辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素免疫法（streptavidin peroxidase，SP法）進(jìn)行組織化學(xué)染色。兔抗人ADM多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人βcatenin多克隆抗體購自美國Proteintech公司，兔抗人P－β－catenin多克隆抗體購自美國Bioworld公司，均1∶100稀釋為工作濃度。即用型第二代免疫組化SP試劑盒購自武漢博士德生物制品公司；所有標(biāo)本均設(shè)陽性對照，并用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.3 免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn) 每張切片于高倍鏡下（× 400）隨機(jī)觀察5個視野，每視野計數(shù)100個細(xì)胞。數(shù)出陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值，小于10％記為陰性表達(dá)，余者為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理，陽性率之間的比較采用Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，兩變量之間的關(guān)聯(lián)性分析采用列聯(lián)表關(guān)聯(lián)性分析，并應(yīng)用Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADM、T－β－catenin及P－β－catenin在骨肉瘤中的表達(dá) 在33例骨肉瘤患者中，總骨肉瘤組織、高分化及低分化骨肉瘤組織的陽性表達(dá)率分別為：ADM 81.8％（27/33）、57.1％（8/14）、100％（19/19），T－βcatenin 90.9（30/33）、85.7％（12/14）、94.7％（18/19）及P－β－catenin 60.6％（20/33）、35.7％（5/14）、78.9％（15/19）（表1）。

ADM在骨軟骨瘤組織無表達(dá)，在骨肉瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在不同分化程度骨肉瘤中陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003＜0.05，圖1、表1）。在高分化骨肉瘤組織中，T－β－catenin在胞質(zhì)胞核中均有表達(dá)，而在低分化骨肉瘤組織中，其僅在胞膜上胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)（圖2）；T－β－catenin在不同分化程度骨肉瘤中陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.561＞ 0.05，表1）。P－β－catenin在高分化骨肉瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)較弱或無表達(dá)，在低分化骨肉瘤組織中，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)增加（圖3）；P－β－catenin在不同分化程度骨肉瘤中陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.029＜0.05，表1）。T－β－catenin及P－β－catenin在骨軟骨瘤組織細(xì)胞內(nèi)較少表達(dá)或無表達(dá)。

圖2 T－β－catenin蛋白在骨軟骨瘤、高分化及低分化骨肉瘤中的表達(dá)Fig.2T－β－catenin protein expressed in osteochondroma，and osteosarcomas of higher and lower differentiation grading（SP，×400）

圖3 P－β－catenin蛋白在骨軟骨瘤、高分化及低分化骨肉瘤中的表達(dá)Fig.3P－β－catenin protein expressed in osteochondroma，and osteosarcomas of higher and lower differentiation grading（SP，×400）

2.2 ADM與T－β－catenin、P－β－catenin蛋白表達(dá)間的相互關(guān)系 根據(jù)Fisher確切概率法分析顯示，ADM 與T－β－catenin蛋白表達(dá)無相關(guān)性（P＝0.078＞0.05，表2）；ADM與P－β－catenin蛋白表達(dá)（r＝0.424，P＝0.025＜0.05）呈正相關(guān)（表3）；T－β－catenin與P－β－catenin蛋白表達(dá)亦無明顯相關(guān)性（P＝0.052＞0.05，表4）。

表2 ADM與T－β－catenin蛋白表達(dá)在人骨肉瘤中的相關(guān)性分析Tab.2 Analysis of the correlation between the expression of ADM and T－β－catenin protein in human osteosarcoma［n（％）］

表3 ADM與P－β－catenin蛋白表達(dá)在人骨肉瘤中的相關(guān)性分析Tab.3 Analysis of the correlation between the expression of ADM and P－β－catenin protein in human osteosarcoma［n（％）］

表4 T－β－catenin與P－β－catenin蛋白表達(dá)在人骨肉瘤中的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of the correlation between the expression of T－β－catenin and P－β－catenin protein in human osteosarcoma ［n（％）］

3 討論

Enneking分級系統(tǒng)將骨肉瘤分為低度惡性（G1）和高度惡性（G2）［10］，有助于選擇治療方案，預(yù)測治療效果。ADM是一種具有廣泛生理或病理作用的內(nèi)源性血管活性肽，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)［11－13］。DAI等［8］已證實(shí)ADM在人骨肉瘤組織中呈陽性表達(dá)，但ADM在不同惡性程度的骨肉瘤中的表達(dá)情況尚無研究報道。本研究依據(jù)Enneking分級，將33例骨肉瘤分為高分化與低分化兩組，結(jié)果顯示ADM在高分化和低分化骨肉瘤中陽性表達(dá)率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示骨肉瘤的惡性程度越高，ADM表達(dá)率越高。分析可能由于惡性程度高的骨肉瘤細(xì)胞較惡性程度低的增殖、分裂迅速，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)形成的缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)ADM的產(chǎn)生；內(nèi)外環(huán)境導(dǎo)致的缺氧或細(xì)胞炎性因子誘導(dǎo)缺氧微環(huán)境，引起ADM或其他因子生成，篩選出骨肉瘤干細(xì)胞并誘導(dǎo)其不斷增殖，形成骨肉瘤。但這需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

Wnt通路的關(guān)鍵因子β－catenin是否活化在骨肉瘤起源中起著重要的調(diào)節(jié)作用，是判斷骨肉瘤預(yù)后的一個重要指標(biāo)［14］。但是，β－catenin在骨肉瘤中表達(dá)升高或降低仍存在爭議。HAYDON等［15］應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察了47例骨肉瘤標(biāo)本，其中33例β－catenin在胞核及胞質(zhì)中高表達(dá)。DAINO等［16］研究同樣證實(shí)β－catenin在骨肉瘤中高表達(dá)，而GSK－3β在骨肉瘤中表達(dá)降低。而CAI等［17］發(fā)現(xiàn)β－catenin在骨肉瘤標(biāo)本和骨肉瘤細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，但在細(xì)胞核中低表達(dá)，提示W(wǎng)nt通路在骨肉瘤中是失活的。本實(shí)驗(yàn)的高分化骨肉瘤的胞質(zhì)胞核均有T－β－catenin表達(dá)；而在低分化骨肉瘤組織中，T－β－catenin僅在胞膜上胞質(zhì)內(nèi)有表達(dá)，高、低分化骨肉瘤中陽性表達(dá)率分別為85.7％和94.7％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明T－βcatenin表達(dá)的高低與骨肉瘤惡性程度無相關(guān)性。而T－β－catenin在骨肉瘤細(xì)胞中的分布可能與骨肉瘤惡性程度有關(guān)。P－β－catenin在骨肉瘤胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在高分化和低分化骨肉瘤中表達(dá)率分別為41.7％和78.9％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明P－β－catenin與骨肉瘤惡性程度有相關(guān)性。因此，出現(xiàn)以上不同結(jié)果可能是許多研究僅僅檢測β－catenin的表達(dá)情況，而忽略了在同一腫瘤組織中其失活狀態(tài)P－β－catenin的表達(dá)情況。

在本實(shí)驗(yàn)33例骨肉瘤中免疫組化檢測的T－βcatenin的表達(dá)，包括了失活狀態(tài)的P－β－catenin及活化的非磷酸化β－catenin。P－β－catenin在低度惡性骨肉瘤中表達(dá)較低，而在高度惡性骨肉瘤中表達(dá)增高，提示β－catenin在高度惡性骨肉瘤中是失活的，而在低惡性骨肉瘤中是活化的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)βcatenin在低惡性程度組織的細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，可能是有活性的β－catenin通過轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)骨肉瘤的良性分化，與CAI等［17］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

另外，ADM與P－β－catenin蛋白的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，說明ADM在骨肉瘤中的表達(dá)可能誘導(dǎo)βcatenin的失活，或β－catenin狀態(tài)的變化影響了ADM的表達(dá)，抑或不是因果關(guān)系而是平行的協(xié)同關(guān)系。因此，需進(jìn)一步在骨肉瘤細(xì)胞中證實(shí)ADM與βcatenin表達(dá)的關(guān)系。

綜上所述，ADM與P－β－catenin蛋白在不同分化程度的人骨肉瘤組織中的陽性表達(dá)率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而T－β－catenin在高、低度惡性骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的分布部位不同，陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ADM與P－β－catenin蛋白之間的表達(dá)具有相關(guān)性。提示ADM與P－β－catenin表達(dá)可作為判斷骨肉瘤惡性程度的指標(biāo)，為進(jìn)一步研究ADM與β－catenin在骨肉瘤的關(guān)系及對骨肉瘤細(xì)胞分化的作用提供了理論依據(jù)。

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（編輯 國 榮）（編輯 國 榮）

Expressions of ADM andβ－catenin in human osteosarcoma and their clinical significance

WU Xue－yuan1，HAO Cui－pei2，GUO Chi－h(huán)ua3，MA Wei3
（1.Department of Orthopedics；2.Department of Gynecology，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi’an 710068；3.Department of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To study the expressions of adrenomedullin（ADM）andβ－catenin in human osteosarcoma of different differentiation grading and their clinical significance.Methods We chose 33 cases of human osteosarcoma with different pathological grading（14 cases of high differentiation grading and 19 cases of low grading）and 10 cases of human osteochondroma to detect the expressions of ADM protein，total（T）β－catenin and phosphorylated （P）β－catenin using immunohistochemical method.Results The expression of ADM was detected in the cytoplasm.In osteosarcomas of higher and lower differentiation grading，the positive rate of ADM was 57.1％（8/14）and100％（19/19），respectively，with significant differences（P＝0.003＜0.05）.The expression of T－β－catenin was observed in both the cytoplasm and the nucleus in higher differentiation grading and in only cytoplasm in lower grading.In osteosarcomas of higher and lower differentiation grading，the positive rate of T－β－catenin was 85.7％ （12/14）and 94.7％（18/19），with no significant difference（P＝0.561＞0.05）.The expression of P－β－catenin was detected in the cytoplasm.In osteosarcomas of higher and lower differentiation grading，the positive rate of P－β－catenin was 35.7％（5/14）and 78.9％（15/19），with a significant difference（P＝0.029＜0.05）.There was a significant correlation between ADM and P－β－catenin（r＝0.424，P＝0.025＜0.05），but no significant correlation between ADM and T－β－catenin（P＝0.078＞0.05）or between T－β－catenin and P－β－catenin（P＝0.052＞0.05）.Conclusion The expressions of ADM and P－β－catenin proteins and the different distributions of expression of T－β －catenin protein in cytoplasm and/or nucleus are important indicators for judging the pathological grading of osteosarcoma.

adrenomedullin（ADM）；β－catenin；osteosarcoma；differentiation

R735

A

10.7652/jdyxb201602025

2015－06－29

2015－10－12

馬巍.E－mail：wologyuan@163.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1418.014.html（2016－02－02）

◇中醫(yī)藥研究◇