謝小娟，潘晶晶，魏力強，陳 葳

（1.陜西省臨床檢驗中心，陜西西安 710068；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710061）

miR－199a－3p靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

謝小娟1，2，潘晶晶2，魏力強1，陳 葳2

（1.陜西省臨床檢驗中心，陜西西安 710068；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710061）

目的 為深入研究miR－199a－3p在膀胱癌形成和發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。方法 分析miR－199a－3p序列，預(yù)測其靶基因和轉(zhuǎn)錄因子，并對靶基因進行GO富集和KEGG Pathway分析；構(gòu)建TF－miR－199a－3p－靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。結(jié)果 miR－199a－3p序列在多物種間具有高度保守性；GO分析發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因參與細胞調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)、細胞大分子生物合成等生物過程（P＜0.01）；KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因顯著富集在上皮細胞的細菌入侵通路、ECM受體的相互作用通路、PI3K－Akt信號通路、MAPK信號通路、小細胞肺癌通路、癌癥中的蛋白聚糖通路等；根據(jù)構(gòu)建的TF－miR－199a－3p－靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，挖掘出可能受miR－199a－3p調(diào)控的重要基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等。結(jié)論 miR－199a－3p可能通過直接靶向作用mTOR，調(diào)節(jié)PI3K－Akt－mTOR信號通路，從而參與膀胱癌的形成和發(fā)展。

miR－199a－3p；生物信息學(xué)；mTOR；GO富集分析；KEGG Pathway分析；膀胱癌；PI3K－Akt；MAPK；蛋白聚糖

miRNA是高度保守的非蛋白編碼的小RNA，長度約22nt。成熟的miRNA通過介導(dǎo)目的基因沉默，使靶miRNA降解，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達水平［1］。miRNA幾乎參與了所有生命活動過程的調(diào)節(jié)，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。多項研究表明許多miRNA參與膀胱癌的進展，文獻報道m(xù)iR－199a－3p在膀胱癌中表達下調(diào)。本研究運用生物信息學(xué)分析，預(yù)測miR－199a－3p的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，并對其靶基因進行GO（gene ontology）富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）Pathway分析，為miR－199a－3p在膀胱癌進展中的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR－199a－3p的同源性分析 采用miRBase （http://mirbase.org/index.shtml）在線檢索各物種的miR－199a－3p序列，進行同源性分析。

1.2 miR－199a－3p的靶基因預(yù)測 采用miRanda（http://www.microrna.org/）、Clip－Seq（http://mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）和miRDB（http://www.mirdb.org/）4個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR－199a－3p的靶基因。

1.3 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的GO分析 將2個在線數(shù)據(jù)庫均預(yù)測到的miR－199a－3p的靶基因，進行GO富集分析。通過物種和基因信息，用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫查找基因的GO注釋信息。根據(jù)基因的GO注釋，選擇本物種的所有基因作為背景基因，以P＜0.01為顯著性閾值得到的GO高頻率注釋相對于背景具有統(tǒng)計意義。Gene Ontology包括細胞組件（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）3部分。

1.4 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的KEGG Pathway分析 將2個在線數(shù)據(jù)庫均預(yù)測到的miR－199a－3p的靶基因，采用生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）在線預(yù)測KEGG Pathway。采用DAVID數(shù)據(jù)庫中軟件附帶的Fisher Exact Test計算KEGG Pathway的P值，以P＜0.05為顯著性閾值得到基因集合的信號通路相對于背景具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 miR－199a－3p轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測 通過miRBase （http://mirbase.org/index.shtml）數(shù)據(jù)庫以及UCSC（http://genome.ucsc.edu/index.html）數(shù)據(jù)庫找出miRNA前體的位置。為了保證結(jié)果的代表性，取其前體上游的5 000bp基因序列進行分析。在JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）數(shù)據(jù)庫中輸入前體的序列并選擇相應(yīng)的參數(shù)進行搜索，得出轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）的位置與名稱。miR－199a－3p與TF結(jié)合可能性評分越接近100，可能性越大。

1.6 TF－miRNA－mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 綜合各種蛋白互作（相互作用）數(shù)據(jù)庫，對靶基因總集建立起蛋白互作關(guān)系；合并TF和miR－199a－3p調(diào)節(jié)關(guān)系、miR－199a－3p和mRNA靶向關(guān)系、靶基因總集的蛋白互作關(guān)系，從而得到miR－199a－3p的TF－miRNA－mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。

2 結(jié)果

2.1 miR－199a－3p的同源性分析 應(yīng)用miRBase數(shù)據(jù)庫在線檢索，發(fā)現(xiàn)人（has）miR－199a－3p基因序列號為MIMAT0000232，其前體70個堿基定位于19號染色體10817426～10817496位。通過miRBase對小鼠（mmu）、熱帶爪蟾（xtr）、牛（bta）、大鼠（rno）、獼猴（mml）、黑猩猩（ptr）等20個物種的miR－199a－3p序列比對分析，發(fā)現(xiàn)has－miR－199a－3p的成熟序列“ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA”在各物種間高度保守（表1）。

表1 各物種miR－199a－3p的成熟序列Tab.1 Mature sequence of miR－199a－3p in various species

2.2 miR－199a－3p的靶基因預(yù)測 miRanda、Clip－Sep、TargetScan、miRDB 4個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR－199a－3p的靶基因個數(shù)分別是0、221、404、296。其中2個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的相同靶基因177個，3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的相同靶基因26個（圖1）。

2.3 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的GO分析 將2個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測到的177個miR－199a－3p的靶基因作GO分析，發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因富集在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等13個細胞組件（P＜0.01），參與磷蛋白結(jié)合、受體信號蛋白活性、轉(zhuǎn)錄抑制物活性等25個分子功能（P＜0.01），涉及細胞調(diào)節(jié)、代謝過程調(diào)節(jié)、細胞大分子生物合成、基因表達等134個生物過程（P＜0.01，表2）。

2.4 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的KEGG Pathway分析 將2個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測到的177個miR－199a－3p的靶基因作KEGG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因顯著富集在上皮細胞的細菌入侵通路、ECM受體的相互作用通路、PI3K－Akt信號通路、MAPK信號通路、細胞內(nèi)吞作用通路、小細胞肺癌通路、癌癥中的蛋白聚糖通路等（P＜0.05，表3）。miR－199a－3p的靶基因參與PI3K－Akt信號通路（圖2）。

圖1 miR－199a－3p的預(yù)測靶基因個數(shù)Fig.1Prediction number of target genes of miR－199a－3p

2.5 miR－199a－3p的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 預(yù)測到miR－199a－3p的轉(zhuǎn)錄因子304個，結(jié)合評分＞80的結(jié)合位點627個，其中126個位點＞90分，13個位點為100分（表4）。

2.6 TF－miRNA－mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 根據(jù)miR－199a－3p預(yù)測的TF、靶基因、靶基因編碼的蛋白構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。對網(wǎng)絡(luò)圖里面的互作關(guān)系進行統(tǒng)計，從而挖掘出可能調(diào)控miR－199a－3p的轉(zhuǎn)錄因子有AP1、FOS、ESR1、BRCA1、CREB1等；可能受miR－199a－3p調(diào)控的基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等（圖4）。

表2 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的GO功能分析結(jié)果Tab.2 Gene ontology of prediction of miR－199a－3p

表3 miR－199a－3p預(yù)測靶基因的KEGG Pathway分析Tab.3 KEGG Pathway of prediction of miR－199a－3p

圖2 miR－199a－3p的預(yù)測靶基因參與PI3K－Akt信號通路Fig.2Predicted target genes of miR－199a－3p participated in PI3K－Akt signal pathway

3 討論

miR－199a－3p定位于19號染色體10817426－ 10817496位，位于DNM2基因16號內(nèi)含子，在多種腫瘤組織和細胞中均有差異表達。DUAN［2］、TIAN等［3］研究表明，miR－199a－3p在骨肉瘤中低表達，通過靶向調(diào)節(jié)mTOR、Met、Stat3、AXL等基因，抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；FORNARI等［4］研究發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p通過調(diào)節(jié)mTOR、c－Met影響肝癌細胞對阿霉素的敏感性；HENRY等［5］發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p靶向CD44分子，減少肝癌細胞的增殖；KINOSE等［6］研究發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p與缺氧相關(guān)，通過下調(diào)c－Met的表達抑制卵巢癌細胞侵襲；HAN等［7］報道m(xù)iR－199a－3p作為抑癌基因，通過靶向NLK，抑制結(jié)直腸癌；MINNA等［8］研究發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p抑制乳頭狀甲狀腺癌；但SONG等［9］報道m(xù)iR－199a－3p在胃癌組織表達上調(diào)，促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移；WANG等［10］進一步研究證實miR－199a－3p通過靶向ZHX1，促進胃癌進展；RATERT［11］、ICHIMI等［12］報道m(xù)iR－199a－3p在膀胱癌組織中表達下調(diào)，其具體的作用機制還有待進一步研究。

表4 miR－199a－3p的預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點Tab.4 Prediction of TF and binding site of miR－199a－3p

圖3 TF－miR－199a－3p－靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3Regulation network diagram of TF－miR－199a－3p－target genes

圖4 預(yù)測的miR－199a－3p轉(zhuǎn)錄因子和靶基因重要性排序Fig.4Theimportance order of TF and target genes of miR－199a－3p

本課題采用4個在線軟件預(yù)測miR－199a－3p的靶基因，取2個軟件都預(yù)測到的相同靶基因進行GO富集和KEGG Pathway分析。GO分析發(fā)現(xiàn)，miR－199a－3p的靶基因富集在細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等細胞組件，參與磷蛋白結(jié)合、受體信號蛋白活性、轉(zhuǎn)錄抑制物活性等分子功能，涉及細胞調(diào)節(jié)、代謝過程調(diào)節(jié)、細胞大分子生物合成、基因表達等生物過程。KEGG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因顯著富集在上皮細胞的細菌入侵通路、ECM受體的相互作用通路、PI3K－Akt信號通路、MAPK信號通路、細胞內(nèi)吞作用通路、小細胞肺癌通路、癌癥中的蛋白聚糖通路等。這些預(yù)測的靶基因參與的信號通路及生物學(xué)過程涉及腫瘤細胞分化和代謝等方面，提示miR－199a－3p可能作為一個抑癌基因，參與腫瘤形成及進展。根據(jù)TF－miR－199a－3p－靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，挖掘出可能受miR－199a－3p調(diào)控的重要基因有mTOR、NFκB、NFκB1、CREB1、CD42等。

文獻報道m(xù)TOR是miR－199a－3p的靶基因之一［2，4］。mTOR（即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）是一種跟PI3K－Akt通路相關(guān)的蛋白激酶，通過磷酸化激活與mRNA翻釋相關(guān)的蛋白p70S6K等增強mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，也能磷酸化滅活翻譯抑制蛋白4EBP1等。Akt通過磷酸化mTOR的Ser2448位點而激活mTOR，提高mRNA翻譯的效率，增加細胞生長和分化相關(guān)蛋白的表達，促進腫瘤發(fā)生［13］。PI3KAkt－mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可以抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，在腫瘤的形成、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。近年來，對PI3K－Akt－mTOR信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，此通路控制著眾多腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的細胞生物學(xué)過程。因此，抑制該通路成為腫瘤預(yù)防和靶向治療的焦點。

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，全球發(fā)病率呈上升趨勢。我國膀胱癌發(fā)病率低于西方國家，但近些年的發(fā)病率有增高的趨勢，嚴重威脅著患者的健康。研究表明，PI3K－Akt－mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。CHEN等［14－15］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K－Akt－mTOR信號通路的遺傳變異，可增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險，并可以預(yù)測肌侵襲性和轉(zhuǎn)移性膀胱癌；SUN等［16］進一步研究證實激活PI3KAkt－mTOR信號通路，可促進膀胱上皮癌侵襲，降低患者生存率；SANGUEDOLCE等［17］進一步研究證實PI3K－Akt－mTOR不僅有預(yù)測膀胱癌發(fā)生的作用，更是膀胱癌治療的靶點；QIAN等［18］證實mTOR在膀胱癌中高表達，其抑制物對治療膀胱癌有益。本研究發(fā)現(xiàn)miR－199a－3p的靶基因富集于PI3K－Akt信號通路，mTOR是其靶基因之一，提示miR－199a－3p可能通過直接靶向作用mTOR，調(diào)節(jié)PI3K－AktmTOR信號通路，從而參與膀胱癌的形成和進展。

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（編輯 國 榮）

Prediction of miR－199a－3p targets gene and its bioinformatics analysis

XIE Xiao－juan1，2，PAN Jing－jing2，WEI Li－qiang1，CHEN Wei2
（1.Shaanxi Center for Clinical Laboratory，Xi’an 710068；2.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To provide theoretical guidance for further research on the role of miR－199a－3p in formation and development of bladder cancer.Methods Mature sequence of miR－199a－3p was analyzed；target genes and transcription factors of miRNA－199a－3p were predicted，and the target genes were analyzed for gene ontology（GO）enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）pathway.Then TF－miRNA－mRNA network diagram was constructed.Results Sequences of miR－199a－3p were highly conserved in various species.In GO analysis，the target genes of miR－199a－3p were enriched in many biological processes，such as regulation of cellular process，regulation of macromolecule metabolic process，and regulation of biological process （P＜0.01）.In KEGG pathway，the target genes were mainly located in bacterial invasion pathway of epithelial cells，ECM－receptor interaction pathway，PI3K－Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，small cell lung cancer pathway，and proteoglycans pathway in the cancer（P＜0.05）.According to the TF－miRNA－mRNA network diagram，the important genes that might be regulated by miR－199a－3p were MYC，SP1，mTOR，NFκB，and NFκB1.Conclusion miR－199a－3p may directly target mTOR and participate in the formation and development of bladder cancer through regulating PI3K－Akt－mTOR signaling pathway.

miR－199a－3p；bioinformatics；mammalian target of rapamycin（mTOR）；gene ontology（GO）enrichment analysis；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）pathway analysis；bladder cancer；PI3KAkt；MAPK；proteoglycan

Q74；R737.14

A

10.7652/jdyxb201602020

2015－07－06

2015－10－09

陳葳.E－mail：chenwei808@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1247.008.html（2016－02－02）