崔曉萍，陳建梅，穆軍山，葉建新，林 敏，王魁花，林 航

（1.福建醫(yī)科大學附屬教學醫(yī)院南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建福州 350025；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院骨科，福建福州 350025）

PTEN通過拮抗PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)干細胞增殖

崔曉萍1，陳建梅2，穆軍山1，葉建新1，林 敏1，王魁花1，林 航1

（1.福建醫(yī)科大學附屬教學醫(yī)院南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建福州 350025；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院骨科，福建福州 350025）

目的 探討PTEN抑制神經(jīng)干細胞增殖的作用，以闡明是否可以通過抑制PTEN蛋白表達來促進神經(jīng)干細胞增殖。方法 取新生24h昆明小鼠海馬組織，分離培養(yǎng)原代神經(jīng)干細胞，并采用免疫熒光檢測鑒定；將所培養(yǎng)的傳代神經(jīng)干細胞隨機分組：正常組、缺血模型組、低氧組（低氧＋缺血模型組）、Lip2000組（低氧＋缺血模型組＋Lip2000空轉(zhuǎn)染組）、PTEN轉(zhuǎn)染組（低氧＋缺血模型組＋Ad5－PTEN轉(zhuǎn)染組）、PTEN干擾組（低氧＋缺血模型組＋Lip2000＋PTENsiRNA干擾組），檢測0、6、24、36、48h不同時間點各組神經(jīng)干細胞的增殖情況，同時檢測PTEN轉(zhuǎn)染后PTEN蛋白在各組神經(jīng)干細胞的表達情況，以及對PI3K－Akt信號通路上標志性蛋白表達的影響。結(jié)果 免疫熒光檢測Nestin以鑒定神經(jīng)干細胞球，在熒光顯微鏡下觀察到綠色明亮且典型的細胞球，球內(nèi)可見清晰結(jié)構(gòu)。MTT測定發(fā)現(xiàn)低氧組、Lip2000組培養(yǎng)36h時神經(jīng)干細胞出現(xiàn)明顯增殖，與模型組、PTEN轉(zhuǎn)染組及PTEN干擾組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中PTEN干擾組的細胞增殖又較模型組、PTEN轉(zhuǎn)染組明顯，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與正常組細胞比較，模型組與PTEN轉(zhuǎn)染組的PTEN表達升高（P＜0.05），且均較正常組降低（P＜0.05），其中低氧組、Lip2000組與PTEN干擾組降低的趨勢相當（P＞0.05）。PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后各組總的Akt和bad未出現(xiàn)明顯變化，但是與正常組比較，模型組與PTEN轉(zhuǎn)染組的PI3K、p－Akt、p－bad表達降低（P＜0.05），其中PTEN轉(zhuǎn)染組的變化較為明顯。低氧組、Lip2000組與PTEN干擾組的PI3K、p－Akt、p－bad表達升高（P＜0.05）。結(jié)論 低氧有助于促進神經(jīng)干細胞增殖，PTEN對PI3K/Akt的抑制作用可能是成體神經(jīng)干細胞增殖受阻的關(guān)鍵因素。

神經(jīng)干細胞；PTEN；PI3K/Akt信號通路；低氧；bad；海馬

隨著對神經(jīng)損傷細胞和分子層面的研究逐漸深入，已更加全面地了解神經(jīng)修復的相關(guān)因素，神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)推翻了神經(jīng)損傷是不可再生的論斷，也使腦血管意外、中樞神經(jīng)退行性疾病、脊髓損傷的治療有了新的希望［1］。如果神經(jīng)干細胞能夠根據(jù)機體修復需要，充分增殖并分化為目標靶細胞，可有效治療中樞神經(jīng)發(fā)生疾病或損傷。然而，這種自發(fā)條件下的修復反應(yīng)微弱，遠不能滿足神經(jīng)再生的需求，以至于在過去相當長一段時間內(nèi)被忽視。

磷酸肌醇三磷酸激酶－絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinsitol 3－OH kinase－RAC－alpha serine/threonine－protein kinase，PI3K－Akt）信號通路廣泛存在于細胞中，是細胞內(nèi)重要的信號通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，調(diào)控細胞增殖、分化、蛋白質(zhì)合成，在細胞生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用［2－3］。據(jù)此推測，理論上如果某種干預措施能夠促進神經(jīng)干細胞對PI3K－Akt信號通路產(chǎn)生積極反應(yīng)，則可以使內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的優(yōu)越性得到充分發(fā)揮。然而事實卻并非如此，隨著研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)內(nèi)存在某種因素在此過程起負性調(diào)控作用。有資料證實，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（mutated in multiple advanced cancers 1，PTEN）可以通過水解PIP3［phosphatidylinositol（3，4，5）－trisphosphate］第3位磷酸基團，對PI3K/Akt通路發(fā)揮抑制作用［4］。而目前尚不清楚PTEN對PI3K/Akt通路的抑制作用是否是成體神經(jīng)干細胞增殖受阻的關(guān)鍵因素。本課題對此進行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康新生24h的昆明小鼠。體質(zhì)量3～5g（南京軍區(qū)福州總院實驗動物中心提供，常規(guī)條件飼養(yǎng)）。胎牛血清（Gibco）、DMEM/F12（1∶1 Dulbecco’s Modified Eagle Media/nutrient mixture F－12），改良Eagle培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco）、5－溴脫氧尿嘧啶核苷（5－bromo－2－deoxy uridine，Brdu）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、堿性成纖維細胞生長因子（basicity fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、鼠抗Nestin（巢蛋白）、兔抗鼠Akt、PI3K、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、PTEN單克隆抗體（美國CST公司），兔抗鼠p－Akt單克隆抗體（美國CST公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、穿梭質(zhì)粒pDC316（AdMax系統(tǒng)的腺病毒載體穿梭質(zhì)粒）、羊抗小鼠異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽［3－（4，5－dimethyl－2－thiazolyl）－2，5－diphenyl－2－H－tetrazolium bromide，MTT］及CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司），熒光倒置相差顯微鏡（尼康儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 小鼠神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 取新生1d小鼠，無菌條件下分離海馬組織，立即置于預冷的DMEM/F12中，機械剪碎后用槍頭吹打成單細胞懸濁液，1 000r/min離心5min，棄上清液，隨后用完全培養(yǎng)基［內(nèi)含bFGF（20ng/mL）、EGF（20ng/mL）、10g/L B27］重懸沉淀物，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨過濾后，以5×105/mL細胞密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)至第3天半量換液1次。當原代培養(yǎng)的神經(jīng)球直徑（d）＝200μm左右進行傳代。收集神經(jīng)球，1 000r/min離心5min，棄上清液，加入1mL ACCUTASE細胞消化液后，以5×105/mL的細胞密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)6～7d時傳代1次，選用第3代神經(jīng)干細胞進行nestin免疫組化鑒定細胞。

1.3 免疫熒光鑒定海馬組織原代神經(jīng)干細胞 取第3代神經(jīng)干細胞以5×105/mL密度接種24孔板內(nèi)（已包被多聚賴氨酸），培養(yǎng)4d后吸棄培養(yǎng)基，經(jīng)40 g/L多聚甲醛室溫固定、3mL/L Triton－X100室溫破膜處理，50mL/L正常羊血清37℃封閉30min棄去，先后加入1∶80稀釋的nestin一抗及FITC標記的羊抗小鼠IgG－FITC孵育后，熒光顯微鏡觀察細胞并照相。

1.4 缺血缺氧細胞模型的制備［5］及實驗分組 收集第3代神經(jīng)干細胞，1 000r/min離心5min，用誘導分化培養(yǎng)液（DMEM/F12中FBS∶B27＝1∶2）對沉淀物進行重懸，采用機械吹打分離的形式將神經(jīng)球分離為單個細胞，以5×105/mL的密度接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，將細胞隨機分為正常組、缺血模型組（模型組）、低氧組（低氧＋模型組）及Lip2000組（低氧＋模型組＋Lip2000空轉(zhuǎn)染組）、PTEN轉(zhuǎn)染組（低氧＋模型組＋Ad5－PTEN轉(zhuǎn)染組）、PTEN干擾組（低氧＋模型組＋Lip2000＋PTENsiRNA干擾組）（具體處理見1.5）。后4組均置于低氧條件下培育，即Thermo Forma孵箱的氧體積分數(shù)調(diào)整為10 mL/L，其他培養(yǎng)條件按常規(guī)進行。其中缺血模型采用氧糖剝奪（OGD）法模擬在體缺血，即細胞培養(yǎng)至第9～10天時，以無糖Earle氏液替代原培養(yǎng)液。Earle氏液放入缺氧罐中預平衡30min后，將培養(yǎng)板置于缺氧罐內(nèi)，930mL/L N2＋70mL/L CO2接缺氧罐的進氣口，出氣口外接水瓶。缺氧罐放于培養(yǎng)箱中至箱體溫度與培養(yǎng)箱一致（37℃），缺氧罐內(nèi)分上層、隔層和下層，上層用來放置細胞和用以燃燒耗盡O2的蠟燭；隔層可模擬正常的CO2培養(yǎng)箱；下層盛超純水以維持罐體內(nèi)合適濕度。通入930mL/L N2＋70 mL/L CO2的混合氣體30min，關(guān)閉缺氧罐進口并置于培養(yǎng)箱內(nèi)3h以模擬腦缺血缺氧狀態(tài)。

1.5 PTEN RNA干擾（RNAi）技術(shù)及轉(zhuǎn)染 將第3代神經(jīng)干細胞接種于24孔板中，每孔5×105個細胞，培養(yǎng)基為DMEM＋100mL/L Hyclone胎牛血清，置37℃含50mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。PTEN siRNA上游引物：5′－GCUGGAACACUUGUCUGUGTT－3′；下游引物：5′－CACAGACAAGUGUUCCAGCTT－3′；根據(jù)Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將4mg穿梭質(zhì)粒pDC316－PTEM與10 μL脂質(zhì)體混合，晃動均勻后將混合物移至培養(yǎng)基中，待細胞生長接近5×106個進行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞生長接近60％融合，棄培養(yǎng)液，更換成200mg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液進行篩選，再次置于37℃含50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h換液1次，約10d后可形成有抗性克隆，選取單一克隆進行擴大培養(yǎng)。

于轉(zhuǎn)染前1d進行細胞計數(shù)，將待轉(zhuǎn)染的處于對數(shù)生長期的神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板中，控制各孔細胞生長密度使其在轉(zhuǎn)染當天密度接近80％。①將神經(jīng)干細胞鋪板在0.5mL不含抗生素含PBS的正常生長的細胞培養(yǎng)基中。②用50μL OPTI－MEMI培養(yǎng)基稀釋1～3μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000試劑，輕輕混勻，室溫水浴5min。③使用50μL不含OPTI－DMEM培養(yǎng)基稀釋0.8～1.0 μg DNA。與第2步稀釋的Lipofectamine2000混合并室溫保持20min。取100μL加入到24孔細胞培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖動混勻，于37℃、50mL/L的CO2孵箱中保溫48h。③使用熒光蛋白發(fā)光計數(shù)法來鑒定各組神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下，觀察計數(shù)每個隨機視野內(nèi)發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)并統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的細胞占觀察到的細胞總數(shù)的百分比率，即為轉(zhuǎn)染總效率。④將轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中進行相關(guān)分組實驗。

1.6 MTT法測神經(jīng)干細胞增殖情況 各組神經(jīng)干細胞按105/mL接種至96孔板，每孔接種10μL，每組3個復孔，在不同時間點（0、6、24、36、48h）每孔加入5g/L MTT 20μL，繼續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，酶標儀在490nm波長處讀取A值。

1.7 Western blot檢測PTEN、PI3K、Akt、bad、p－Akt、p－bad蛋白表達情況 于0、6、24、36、48h時間點消化各組神經(jīng)干細胞，加1mL裂解緩沖液提取蛋白，根據(jù)DAB方法測定濃度后于100℃金屬浴中變性。每泳道上樣量為50μg蛋白。電泳（40g/L濃縮膠，120g/L分離膠，120V，50mA，1.5h）結(jié)束后，PVDF膜轉(zhuǎn)印，50V、100mA，2h。50g/L脫脂奶粉液封閉2h，TBS清洗，分別加入稀釋的抗PTEN、PI3K、Akt、p－Akt、bad、p－bad和β－actin抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBS清洗，加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG （1∶2 000）室溫2h，TBS清洗。將濾膜放于顯色液中顯色后顯影，圖像用生物分析系統(tǒng)（Bio－Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（珔x±s）形式表示，采用t檢驗，符合正態(tài)分布采用方差分析，不符合正態(tài)分布則采用兩個獨立樣本秩和檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗或秩和檢驗，α＝0.05，采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細胞的免疫熒光鑒定 海馬組織剛分離出來的神經(jīng)干細胞接種于培養(yǎng)瓶后呈現(xiàn)圓形，立體感強且折光理想，培養(yǎng)3d后神經(jīng)干細胞增殖使神經(jīng)球的體積和數(shù)目隨著時間的推移不斷增加，直到培養(yǎng)7d出現(xiàn)大小不一的神經(jīng)球，直徑約200μm。機械吹打神經(jīng)球成單細胞后繼續(xù)培養(yǎng)，將原代和傳代的神經(jīng)干細胞接種到有多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)4h后進行熒光鑒定，Nestin標記均為陽性（圖1）。

2.2 MTT法測定神經(jīng)干細胞增殖情況 用MTT對不同時間點神經(jīng)干細胞增殖情況測定，低氧組、Lip2000組神經(jīng)干細胞培養(yǎng)36h出現(xiàn)明顯增殖，與模型組、PTEN轉(zhuǎn)染組及PTEN干擾組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中PTEN干擾組的細胞增殖又較模型組、PTEN轉(zhuǎn)染組明顯，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

圖1 神經(jīng)干細胞的鑒定Fig.1The identification of neural stem cells（×200）

2.3 不同組別神經(jīng)干細胞PTEN的表達情況 與正常組細胞比較，模型組與PTEN轉(zhuǎn)染組的PTEN表達升高（P＜0.05），其余各組均較正常組降低（P＜0.05），其中低氧組、Lip2000組與PTEN干擾組降低的趨勢相當（P＞0.05，圖2）。

表1 各組神經(jīng)干細胞不同時間點的增殖情況Tab.1 Proliferation detected by MTT in different groups of neural stem cells （n＝3，珔x±s）

2.4 轉(zhuǎn)染PTEN對細胞中PI3K、Akt、bad以及p－Akt、p－bad表達的影響 經(jīng)過PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后各組總的Akt和bad無出現(xiàn)明顯變化，但是與正常組比較，模型組與PTEN轉(zhuǎn)染組的PI3K、p－Akt、p－bad表達降低（P＜0.05），其中PTEN轉(zhuǎn)染組的變化較為明顯。低氧組、Lip2000組與PTEN干擾組的PI3K、p－Akt、p－bad表達升高（P＜0.05，圖3、表2）。

3 討論

神經(jīng)干細胞具有高度增殖、自我更新及分化能力，在一定條件下能不斷進行有絲分裂并分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的原始母細胞。在理想狀態(tài)下神經(jīng)干細胞是中樞神經(jīng)修復的重要貯備及源泉，通過神經(jīng)干細胞的不斷增殖及遷移，可以到達凋亡細胞周圍，參與細胞及組織更新。因此，細胞替代被認為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病最有前途的治療措施。然而，盡管細胞實驗及動物實驗的結(jié)果讓人鼓舞，臨床上應(yīng)用也取得了一定的進展，但離大規(guī)模應(yīng)用仍有相當長的一段距離，其療效與神經(jīng)干細胞所擁有的潛能相去甚遠。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，PI3K－Akt通路可能在腦缺血后神經(jīng)干細胞增殖過程發(fā)揮重要作用，通過低氧干預，促進了神經(jīng)干細胞的增殖。這提示在腦內(nèi)存在PI3K/Akt活化并促進神經(jīng)干細胞增殖的病理生理基礎(chǔ)：腦缺血可以明顯激活PI3K/Akt通路，理論上推測由腦脊髓損傷后導致的缺血缺氧環(huán)境應(yīng)該可以明顯促進神經(jīng)干細胞增殖。但事實卻并非如此，這提示在此過程中，中樞神經(jīng)內(nèi)存在某種因素起負性調(diào)控作用。

PTEN基因是具有蛋白磷酸酯酶活性的抑癌基因。多項研究表明，PTEN可以通過水解PIP3第3位磷酸基團，對PI3K/Akt通路發(fā)揮抑制作用［15］，如果PTEN基因缺失，則可以激活PI3K/Akt，從而調(diào)控細胞周期、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成和多藥耐藥等環(huán)節(jié)。近年來，PTEN在中樞神經(jīng)的作用逐漸受到重視，GROSZER等［6］通過攜帶loxP序列的PTEN－loxp雌鼠與攜帶nestin啟動子的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因雄鼠進行雜交，發(fā)現(xiàn)PTEN與發(fā)育期腦的神經(jīng)干細胞正常增殖與自我更新密切相關(guān)，PTEN缺失導致神經(jīng)干細胞大量增殖，鼠腦體積增大；CHRISTIE［7］在體外實驗中發(fā)現(xiàn)PTEN可抑制神經(jīng)干細胞對生長因子刺激的反應(yīng)，降低神經(jīng)干細胞的更新能力；目前的研究也提示，PTEN的表達與中樞神經(jīng)損傷后再生受阻密切相關(guān)，隨著年齡的增加，運動神經(jīng)元內(nèi)mTOR （PI3K/Akt通路的下游基因）水平降低是皮質(zhì)脊髓束再生失敗的重要因素，通過去除PTEN基因，可以明顯提高mTOR水平，促進了神經(jīng)的再生［8－10］?；赑TEN的重要作用，目前一些學者提出以抑制PTEN為靶點來促進中樞神經(jīng)再生的新策略。

圖2 不同組別神經(jīng)干細胞PTEN蛋白的表達變化Fig.2The expression of PTEN protein in different groups of neural stem cells

圖3 不同組別神經(jīng)干細胞PI3K、Akt、bad、p－Akt、p－bad蛋白的表達變化Fig.3The expressions of PI3K，Akt，bad，p－Akt and p－bad protein in different groups of neural stem cells

表2 不同組別神經(jīng)干細胞PI3K、Akt、bad、p－Akt、p－bad蛋白的表達變化Tab.2 The expressions of PI3K，Akt，bad，p－Akt and p－bad protein in different groups of neural stem cells

基于上述研究，本研究利用缺血缺氧模型下的神經(jīng)干細胞進行實驗觀察，利用重組腺病毒Ad5－PTEN轉(zhuǎn)染增強神經(jīng)干細胞PTEN表達，以及PTEN siRNA干擾技術(shù)沉默神經(jīng)干細胞PTEN表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時間點接受PTEN轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細胞增殖明顯少于正常組及PTEN干擾組，說明PTEN可以明顯降低神經(jīng)干細胞的活性及增殖能力。研究中使用低氧作為干預手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧確實可以促進神經(jīng)干細胞的增殖。經(jīng)過PTEN轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細胞內(nèi)PTEN表達量增強；PI3K/Akt信號通路的標志蛋白表達結(jié)果顯示，經(jīng)過PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，雖然各組總的Akt和bad無出現(xiàn)明顯變化，但是PTEN轉(zhuǎn)染組的PI3K、p－Akt、p－bad表達則明顯降低，而PTEN干擾組中上述指標降低趨勢有所扭轉(zhuǎn)，PTEN轉(zhuǎn)染受到干擾后神經(jīng)干細胞出現(xiàn)p－Akt表達增加，抑制了其直接下游分子bad的表達，而上調(diào)的bad磷酸化水平，總體上調(diào)了pAkt/Akt、p－bad/bad蛋白比值，從而抑制神經(jīng)干細胞的凋亡，再次證明PI3K/Akt的活化受到PTEN的負性調(diào)控。

PI3K－Akt/PTEN信號通路可能在缺氧條件下對神經(jīng)干細胞增殖具有重要作用，PTEN對神經(jīng)干細胞增殖有抑制作用。因此，沉默PTEN基因可為治療中樞神經(jīng)疾病提供新靶向。

［1］OKANO H.Neural stem cells and strategies for the regeneration of the central nervous system［J］.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86（4）：438－450.

［2］BABA T.Electrical stimulation of the cerebral cortex exerts antiapoptotic，angiogenic，and anti－inflammatory effects in ischemic stroke rats through phosphoinositide 3－kinase/Akt signaling pathway［J］.Stroke，2009，40（11）：e598－605.

［3］VANHAESEBROECK B，GUILLERMET－GUIBERT J，GRAUPERA M，et al.The emerging mechanisms of isoform－specific PI3K signalling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11（5）：329－341.

［4］BUNNEY TD，KATAN M.Phosphoinositide signalling in cancer：beyond PI3K and PTEN［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（5）：342－352.

［5］HE K，YAN L，PAN CS，et al.ROCK－dependent ATP5D modulation contributes to he protection of notoginsenoside NR1 against ischemia/reperfusion－induced myocardial injury［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，10（1）：572－581.

［6］GROSZER M，ERICKSON R，SCRIPTURE－ADAMS DD，et al.Negative regulation of neural stem/progenitor cell proliferation by the PTEN tumor suppressor gene in vivo［J］.Science，2001，294（5549）：2186－2189.

［7］CHRISTIE KJ，WEBBER CA，MARTINEZ JA，et al.PTEN inhibition to facilitate intrinsic regenerative outgrowth of adult peripheral axons［J］.J Neurosci，2010，30（27）：9306－9315.

［8］LIU K，LU Y，LEE JK，et al.PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons［J］.Nat Neurosci，2010，13（9）：1075－1081.

［9］張軍普，許雯，劉向輝.PTEN、E－cd和MMP－9在人腦膠質(zhì)瘤的表達和意義［J］.山東大學學報（醫(yī)學版），2010，48（2）：109－112.

［10］LIU G，DETLOFF MR，MILLER KN，et al.Exercise modulates microRNAs that affect the PTEN/mTOR pathway in rats after spinal cord injury［J］.Exp Neurol，2012，233（1）：447－456.

PTEN inhibits the proliferation of neural stem cells via the antagonism of PI3K/Akt signaling pathway

CUI Xiao－ping1，CHEN Jian－mei2，MU Jun－shan1，YE Jian－xin1，LIN Min1，WANG Kui－h(huán)ua1，LIN Hang1
（1.Department of Neurology，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Army Command，Clinical Medical College of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025；2.Department of Orthopedics，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Army Command，Clinical Medical College of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，China）

Objective To explore the role of PTEN in the suppression of neural stem cells so as to clarify whether neural stem cell proliferation can be promoted by regulating the PI3K－Akt/PTEN expression level.Methods We removed the hippocampus from neonatal 24 h Kunming mice，isolated and cultured the generation of neural stem cells，which were then identified by immunofluorescence test.We randomly grouped the cultured neural stem cells into normal group，ischemia model group，hypoxia group（hypoxia＋ischemia model group），Lip2000 group（hypoxia＋ischemia model group＋Lip2000 null transfection group，PTEN transfection group（hypoxia＋ischemia model group＋Ad5－PTEN transfection group），and PTEN interference group（hypoxia＋ischemia model group＋Lip2000＋PTENsiRNA interference group）.We detected the proliferation of neural stem cells in the groups at different time points，and PTEN protein expression of neural stem cells in each group after PTEN transfection， and the effect on iconic protein on Akt－PI3K signaling pathway.Results （1）Nestin identification of the neural stem cells was tested by immunofluorescence.We observed green bright and typical cell spheroids under fluorescence microscope；the clear structure could be seen within spheroids.（2）We determined the proliferation of neural stem cells at different time points by MTT.After 36 h of culture，the neural stem cells had obvious proliferation in the hypoxia group and Lip2000 group compared with the model group，the PTEN transfection group and PTEN interference group（P＜0.05），including the cell proliferation of PTEN interference group compared to that of the model group，and PTEN transfection group obviously，the differences were also significant（P＜0.05）；（3）Compared with the cells in the normal group，PTEN expression increased in the model group and PTEN gene transfection group（P＜0.05）；it was all lower in other groups than in the normal group（P＜0.05）.The trend of decrease was similar in hypoxia group，Lip2000 group，and PTEN interference group（P＞0.05）；（4）After PTEN plasmid transfection，there were no apparent changes in the total Akt and bad in the groups，but compared with the normal group，PI3K，p－Akt，and p－bad expressions in model group and PTEN gene transfection group reduced（P＜0.05），with the more obvious changes in the PTEN transfection group.PI3K，p－Akt，and p－bad expressions in the hypoxia group，Lip2000 group and PTEN interference group increased（P＜0.05）.Conclusion Hypoxia contributes to promoting the proliferation of neural stem cells，and the inhibition of PTEN on PI3K/Akt might be the key factor for blocked proliferation of adult neural stem cells.

neural stem cell；PTEN；PI3K/Akt signaling pathway；hypoxia；bad；hippocampus

R741.05

A

10.7652/jdyxb201602019

2015－02－02

2015－10－21

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助（No.12MA097）Supported by Nanjing Military Command Medical Scientific Research Funds（No.12MA097）

林航.E－mail：3122773981@qq.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1249.010.html（2016－02－02）