李 娜，趙 敏

（1.青海大學附屬醫(yī)院眼科，青海西寧 810001；2.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，重慶 400016）

羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)歸及其影響因素

李 娜1，趙 敏2

（1.青海大學附屬醫(yī)院眼科，青海西寧 810001；2.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，重慶 400016）

目的 研究羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)歸并探討其影響因素。方法 取15只新西蘭大白兔，將二氯三苯胺熒光素（dichlorotriazinyl aminofluoresclin，DTAF）標記的羊膜埋植于角膜基質(zhì)內(nèi)。術(shù)后進行臨床觀察，并于4、8、13、17、22周取材做HE染色觀察組織病理學改變，激光共聚焦顯微鏡檢查追蹤羊膜蹤跡，以及22周取材做角膜透射電鏡檢查，觀察超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 HE染色術(shù)后4周可見多層均質(zhì)紅染的羊膜組織彎曲排列，結(jié)構(gòu)保留完整，基底膜和實質(zhì)層未溶解。術(shù)后8周，羊膜組織仍呈均質(zhì)紅染的條狀結(jié)構(gòu)，實質(zhì)層較完整。術(shù)后13周羊膜形態(tài)漸顯模糊，但仍呈條帶狀，少量角膜細胞聚集在羊膜周圍。術(shù)后17周明顯可見碎片狀的羊膜組織。術(shù)后22周角膜基質(zhì)內(nèi)存留小片狀羊膜組織。激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)羊膜在角膜基質(zhì)內(nèi)可以存留22周以上。術(shù)后22周角膜透射電鏡可見整合于角膜基質(zhì)中的羊膜基質(zhì)膠原纖維成分較不規(guī)則，羊膜周圍角膜基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。結(jié)論 羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)存留時間可長達22周以上，羊膜可以融合于角膜組織中，作為替代材料為行角膜移植手術(shù)爭取了時間。

羊膜移植；角膜；轉(zhuǎn)歸

羊膜在眼科領域中作為組織材料被廣泛應用，尤其在治療角膜潰瘍［1］、急性眼表損傷［2］中，羊膜作為生物膜起著非常重要的作用，不僅填補角膜缺損、重建眼表結(jié)構(gòu)、防止角膜穿孔，而且可以抑制纖維瘢痕形成、避免排斥反應的發(fā)生。但是，關于羊膜移植于角膜后的生物學行為以及轉(zhuǎn)歸問題一直是人們爭論的焦點。傳統(tǒng)研究認為羊膜移植于眼組織后的轉(zhuǎn)歸為羊膜排斥、羊膜溶解或羊膜脫落。目前，有個別臨床研究報道羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)可以與宿主長時間共存、發(fā)生融合［3］，但是并未從超微結(jié)構(gòu)角度對羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的生物學行為進行研究。因此，本實驗建立動物模型，長期追蹤羊膜在角膜基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，希望能夠更好地指導臨床工作。本實驗用二氯三苯胺熒光素（dichlorotriazinyl aminofluoresc1in，DTAF）標記羊膜，然后將DTAF標記的羊膜填入兔角膜基質(zhì)中，在激光共聚焦顯微鏡下追蹤羊膜蹤跡［4］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選擇新西蘭大白兔15只（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供），雌雄不分，體質(zhì)量2.0 ～2.5kg，實驗前用裂隙燈檢查排除眼部疾病，選擇雙眼作為實驗眼，符合相關原則。

1.2 羊膜的準備 ①羊膜的制備及保存。新鮮羊膜在制備時需要對取羊膜的個體做血清學檢查，排除肝炎病毒（HBV、HCV），梅毒及艾滋病毒（HIV）等感染，待孕婦行剖宮產(chǎn)后獲得胎盤，將胎盤沖洗干凈，鈍性分離羊膜和絨毛膜，將羊膜浸泡于抗生素生理鹽水（含慶大霉素1×106U/L、兩性霉素B 2.5mg/L）20 min后，上皮面朝上，平鋪于硝酸纖維濾紙上，剪成3.5cm×3.5cm小塊。放入消毒純甘油瓶中4℃冰箱保存［5－6］。②DTAF標記羊膜。將保存羊膜用平衡鹽液浸泡20min制作大小約3mm×6mm矩形羊膜植片，然后將植片完全浸泡于DTAF溶液中1min，取出染色后的羊膜用PBS溶液浸泡沖洗。DTAF標記后的羊膜15min內(nèi)使用。

1.3 手術(shù)方法 速眠新Ⅱ0.20mL/kg肌肉注射，鹽酸奧布比卡因眼表面麻醉。常規(guī)消毒鋪巾開瞼。在12∶00方位，向后分離角膜緣處球結(jié)膜，在角膜緣后界約1mm部位用剃須刀做一個長約4mm橫形切口，分離至角膜緣，用虹膜復位器在角膜基質(zhì)內(nèi)鈍性分離大小約為3mm×6mm的角膜囊袋，裁取相應大小的羊膜填入囊袋中，盡量將羊膜鋪平。手術(shù)后每日滴氧氟沙星滴眼液3次，連續(xù)使用7d后停藥。

1.4 術(shù)后觀察指標 ①臨床觀察。術(shù)后每日用手持式裂隙燈觀察羊膜情況、眼表分泌物、結(jié)膜充血水腫及角膜混濁、新生血管等情況。②組織病理、激光共聚焦顯微鏡及透射電鏡觀察。術(shù)后4、8、13、17、22周5個時間點，每個時間點空氣栓塞致死3只動物。取術(shù)區(qū)角膜組織，常規(guī)病理制片，其他新鮮術(shù)區(qū)組織立即包埋于OCT中進行冰凍切片（厚度為8μm），碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma，美國）復染角膜組織的細胞核，激光共聚焦顯微鏡檢查，術(shù)后22周術(shù)區(qū)角膜組織標本固定于20g/L戊二醛中送透射電鏡檢查。

2 結(jié)果

2.1 羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的術(shù)后臨床觀察 角膜于術(shù)后1周內(nèi)無混濁，結(jié)膜無明顯充血、水腫，眼表無分泌物，肉眼明顯看見角膜組織內(nèi)有黃色致密的條狀組織，為手術(shù)時埋藏的羊膜，羊膜溶解現(xiàn)象不明顯，顏色與移植前無明顯改變。術(shù)后4周條狀的黃色致密組織顏色變淺，形狀略顯不規(guī)則。隨時間推移，角膜組織內(nèi)黃色痕跡顏色逐漸變淡，角膜透明度提高，眼表光滑，但至觀察結(jié)束時，淺黃色痕跡仍然存在，通過肉眼和裂隙燈檢查無法準確判斷其性質(zhì)（圖1）。

圖1 羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的術(shù)后臨床觀察結(jié)果Fig.1Clinical observation after amniotic membrane transplantation into corneal stroma

2.2 羊膜移植術(shù)后角膜HE染色的病理觀察結(jié)果術(shù)后4周可見多層均質(zhì)紅染的羊膜組織彎曲排列，結(jié)構(gòu)保留完整，基底膜和實質(zhì)層未溶解。HE染色顯示上皮細胞胞核和胞質(zhì)均質(zhì)紅染，提示胞核崩解，細胞已死亡，羊膜周圍包被有少量角膜細胞及排列整齊的基質(zhì)膠原纖維。術(shù)后8周，羊膜組織仍呈均質(zhì)紅染的條狀結(jié)構(gòu)，實質(zhì)層較完整。術(shù)后13周羊膜形態(tài)漸顯模糊，但仍呈條帶狀，少量角膜細胞聚集在羊膜周圍。術(shù)后17周明顯可見碎片狀的羊膜組織。術(shù)后22周角膜基質(zhì)內(nèi)存留小片狀羊膜組織（圖2）。整個觀察過程中羊膜周圍無炎癥細胞侵潤，角膜厚度穩(wěn)定，基質(zhì)膠原纖維排列整齊，角膜內(nèi)皮細胞層及后彈力層均無明顯改變。病理切片顯示最表層結(jié)構(gòu)是角膜上皮細胞，第2層是前彈力層，第3層是基質(zhì)，第4層是羊膜，其后依次為角膜基質(zhì)層，后彈力層及內(nèi)皮層。

2.3 羊膜組織在激光共聚焦顯微鏡檢查下的熒光變化 DTAF熒光標記的羊膜發(fā)出黃綠色熒光，PI熒光標記的角膜細胞核表現(xiàn)為紅色熒光。術(shù)后4周在紅色熒光背景中明顯看見一彎曲、厚度不均的黃綠色熒光條帶，熒光強度大體一致，其他觀察時間點切片中，角膜基質(zhì)中均可看見黃綠色的熒光條帶，熒光強度較前減弱，周圍角膜基質(zhì)中無黃綠色熒光滲漏（圖3）。

圖2 羊膜移植術(shù)后角膜HE染色的病理觀察結(jié)果Fig.2Pathological results of HE staining of cornea observed after amniotic membrane transplantation（×200）

圖3 羊膜組織在激光共聚焦顯微鏡檢查下的熒光變化Fig.3Fluorescence changes of amniotic membrane under the laser confocal microscope（Scale bar＝150μm）

2.4 角膜基質(zhì)內(nèi)羊膜組織的透射電鏡檢查 術(shù)后22周可見角膜基質(zhì)成纖維細胞排列大體整齊，整合于角膜基質(zhì)中的羊膜基質(zhì)膠原纖維成分較不規(guī)則，羊膜周圍角膜基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。角膜上皮基底細胞與角膜前基質(zhì)連接緊密，形成橋?；虬霕蛄＿B接（圖4）。

圖4 羊膜移植術(shù)后22周時透射電鏡下的變化Fig.4TEM of the AM and cornea changes at week 22after surgery（Scale bar＝1μm）

3 討論

3.1 DTAF追蹤羊膜蹤跡 本實驗的主要目的之一是追蹤羊膜蹤跡，研究羊膜能否長期存留于角膜基質(zhì)內(nèi)，所以我們采用DTAF熒光染料標記羊膜。DTAF是一種比病理組織、透射電子顯微鏡更為精確的方法用來追蹤羊膜。DTAF是一種熒光染料，在激光共聚焦顯微鏡下呈黃綠色熒光，在生理狀態(tài)下以共價鍵的方式特異性的結(jié)合于膠原組織。因此，它可以精確地對活體組織進行熒光標記，并且這種熒光可以在自然狀態(tài)下保持長達一年時間不悴滅［4］。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)羊膜在角膜基質(zhì)內(nèi)可以存留22周以上。

3.2 羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)歸 本實驗將羊膜埋藏到角膜基質(zhì)內(nèi)觀察羊膜與受體之間的相互作用。病理切片發(fā)現(xiàn)羊膜術(shù)后13周內(nèi)結(jié)構(gòu)基本完整，周圍被排列規(guī)則的角膜基質(zhì)與少量角膜細胞包圍；術(shù)后17周羊膜部分溶解，局部可見碎片狀的淡紅色疏松羊膜組織；術(shù)后22周小片狀的羊膜組織兩端嵌在規(guī)則排列的膠原纖維間，成為角膜基質(zhì)層的一部分。整個觀察過程中均無炎癥反應，局部無纖維組織增生，角膜層次結(jié)構(gòu)清晰。激光共聚焦檢查證實羊膜在基質(zhì)內(nèi)存留時間長達22周以上。同時，透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)整合在角膜基質(zhì)內(nèi)的羊膜及其周圍角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。所以，我們認為羊膜埋藏到角膜基質(zhì)內(nèi)后，部分羊膜緩慢發(fā)生溶解，而剩余羊膜與角膜組織融為一體，成為角膜結(jié)構(gòu)的一部分，長時間存留，即羊膜與角膜組織間發(fā)生融合。羊膜是否能夠在角膜中存留更長時間，還需進一步研究。

3.3 影響羊膜轉(zhuǎn)歸的相關因素

①移植部位。相關研究報道羊膜溶解速度與移植部位有關。WANG等［7］發(fā)現(xiàn)同種異體移植的鼠羊膜上皮細胞7d在結(jié)膜內(nèi)失去活力，21d在角膜中消失，在前房內(nèi)存活8周，甚至更長，表明羊膜細胞存活時間與宿主免疫原性程度有關。GRIS等［8］對2位藥物治療無效的神經(jīng)性角膜潰瘍患者進行羊膜嵌入術(shù)，發(fā)現(xiàn)第1位患者，角膜無炎癥反應和新生血管，羊膜緩慢被吸收，羊膜移植術(shù)后3個月，仍可見羊膜碎片，病變角膜組織中無炎癥反應；第2位患者，角膜組織中有新生血管和大量炎癥細胞，羊膜完全被吸收。

羊膜透明無血管、神經(jīng)和淋巴管抗原性極低，移植后不發(fā)生排斥反應［9］。相關研究報道，羊膜移植體內(nèi)后抑制角膜上皮IL－1β的表達，減少炎癥反應及移植排斥作用，具有良好的組織相容性［10］。并且角膜自身情況對羊膜眼表移植后的轉(zhuǎn)歸有極其重要的影響。正常角膜既無血管也無淋巴組織，所以角膜移植是所有器官移植中成功率最高的手術(shù)。組織病理切片發(fā)現(xiàn)，羊膜周圍的角膜基質(zhì)既無炎癥細胞浸潤，也無新生血管生長，這充分說明了部分羊膜可以長期存在于相對正常的角膜基質(zhì)環(huán)境中，并不會引起角膜發(fā)生排斥反應。

②移植方式。羊膜移植術(shù)分為羊膜遮蓋術(shù)、嵌入術(shù)和填充術(shù)，不同手術(shù)方式影響羊膜轉(zhuǎn)歸。SIPPEL等［11］提出羊膜遮蓋術(shù)是將羊膜整個覆蓋于角鞏膜區(qū)域的表面，羊膜植片上皮面朝上，緊貼角膜上皮，在植片邊緣，連帶其下覆蓋的結(jié)膜，一起固定縫合于淺層鞏膜。羊膜植片的轉(zhuǎn)歸是通常在半個月內(nèi)發(fā)生脫落。羊膜嵌入術(shù)是將羊膜植片修剪為略大于缺損區(qū)，上皮面朝上，植片邊緣固定在創(chuàng)緣周圍角膜［11］。羊膜植片通常發(fā)生自溶。本實驗采用的是羊膜填充術(shù)，將羊膜植入角膜囊袋內(nèi)，填充角膜基質(zhì)，雖然肉眼及裂隙燈檢查未準確觀察到羊膜的轉(zhuǎn)歸，但術(shù)后各時間點組織病理切片、激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡均證實了隨著時間的延長羊膜整合于基質(zhì)中。這說明，手術(shù)方式對羊膜轉(zhuǎn)歸起到了重要的作用。

3.4 羊膜填充術(shù)的應用前景 羊膜移植于角膜基質(zhì)內(nèi)后，與角膜組織融合，能夠修補角膜缺損，成為角膜基質(zhì)重建的材料之一。角膜移植術(shù)是最終治療角膜潰瘍或穿孔的方法，但由于供體材料來源困難，術(shù)后排斥反應等并發(fā)癥多，所以可以利用羊膜層間充填或聯(lián)合部分板層角膜移植治療角膜潰瘍及穿孔，并且減輕角膜炎瘢痕化程度和新生血管形成。該術(shù)式中層間羊膜作為一種生物瓣，層間填充，作為基質(zhì)替代物，提供膠原組織，能夠封閉角膜穿孔，促進基質(zhì)愈合，可使角膜逐漸透明，恢復一定視力，但不能完全透明。角膜層間羊膜植入還可以治療大泡性角膜病變［12－13］。本手術(shù)可減輕角膜水腫，改善眼部刺激癥狀，解除病痛；不影響再次行以增視為目的的穿透角膜移植手術(shù)，對貧窮、落后及角膜供體匱乏的地區(qū)而言是治療此病的有效方法。

［1］黃祖恩.多層羊膜移植術(shù)治療深層蠶食性角膜潰瘍［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11（10）：137－138.

［2］CLARE G，SULEMAN H，BUNCE C，et al.Amniotic membrane transplantation for acute ocular burns［J］.Cochrane Database Syst Rev，2012，9（9）：262－269.

［3］程燕，吳潔，高偉，等.共焦顯微鏡觀察真菌性角膜潰瘍多層羊膜移植術(shù)后的轉(zhuǎn)歸［J］.眼科新進展，2012，32（10）：972－975.

［4］CONNON CJ，NAKAMURA T，QUANTOCK AJ，et al.The persistence of transplanted amniotic membrane in corneal stroma［J］.Am J Ophthalmol，2006，141（1）：190－192.

［5］李克.羊膜在眼科的應用進展［J］.河北醫(yī)學，2012，18（5）：680－ 682.

［6］宋學英，楊慧春，齊紹文，等.早期羊膜移植治療眼表燒傷［J］.實用醫(yī)藥雜志，2012，29（1）：26－27.

［7］WANG M，YOSHIDA A，KAWASHIMA H，et al.Immunogenicity and antigenicity of allogeneic amniotic epithelial transplants grafted to the cornea，conjunctiva，and anterior chamber ［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47（4）：1522－1532.

［8］GRIS O，WOLLEY－DOD C，GUELL JL，et al.Histologic findings after amniotic membrane graft in the human cornea［J］.Ophthalmology，2002，109（3）：508－512.

［9］LAI JY，LUE SJ，CHENG HY，et al.Effect of matrix nanostructure on the functionality ofcarbodiimide cross－linked amniotic membranes as limbal epithelial cell scaffolds［J］.J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2048－2062.

［10］李彬斌，周清，姚敏，等.人羊膜上皮細胞培養(yǎng)液抑制角膜炎癥的實驗研究［J］.器官移植，2013，4（1）：12－18.

［11］SIPPEL KC，MA JJ，F(xiàn)OSTER CS.Amniotic membrane surgery ［J］.Curr Opin Ophthalmol，2001，12（4）：269－281.

［12］王超慶，李燕飛，程秀春，等.角膜基質(zhì)針刺聯(lián)合羊膜移植術(shù)治療大泡性角膜病變［J］.國際眼科雜志，2014，14（6）：1127－1129.

［13］張瑞帆，劉治容.角膜上皮下羊膜移植術(shù)聯(lián)合繃帶式角膜接觸鏡治療大泡性角膜病變療效分析［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2014，11（4）：116－118.

（編輯 韓維棟）（編輯 韓維棟）

Outcome and influencing factors of amniotic membrane transplanted into corneal stroma

LI Na1，ZHAO Min2
（1.Department of Ophthalmology，the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810001；2.the First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the turnover and factors influencing amniotic membrane transplantation into corneal stroma.Methods Amniotic membrane stained with dichlorotriazinyl aminofluoresclin（DTAF）was implanted into the corneal stroma of 15 New Zealand white rabbits.After transplantation，we observed the clinical changes.The tissue samples from grafted area were observed with HE staining and laser confocal microscope to trace amniotic membrane at 4，8，13，17 and22 week after surgery.And the tissue samples at week22 after surgery from grafted area were also observed by transmission electron microscopy.Results After 4 weeks of operation，amniotic membrane tissue bent with visible multi－layer homogeneous red dye.The structure remained intact；basement membrane and stroma were no dissolved.After 8 weeks，amniotic tissue was a strip structure of homogeneous red dye，and the substance layer was complete.After 13 weeks，amniotic membrane morphology appeared fuzzy，but still took the shape of strips；a small number of corneal cells accumulated around the amniotic membrane.At 17 weeks after operation，fragmented amnion was evident.At 22 weeks after operation，small pieces of amnion tissue remained in the corneal stroma.Laser scanning confocal microscopy revealed that amniotic membrane could retain for over 22 weeks in the corneal stroma.After 22 weeks，amnion stroma collagen fibers that were integrated into the corneal stroma were irregular.Corneal stromal ultrastructure surrounding the amniotic membrane did not obviously change.Conclusion Retention time of amniotic membrane transplanted into corneal stroma can be as long as over 22 weeks and amniotic membrane can be merged into the corneal tissue as a substitute，which wins time for corneal transplantation operation.

amniotic membrane transplantation；cornea；turnover

R772.2

A

10.7652/jdyxb201602018

2015－08－07

2015－12－04

重慶市科學基金資助（No.2003－23）Supported by Chongqing Science and Technology Commission（No.2003－23）

趙敏.E－mail：minzhao2002@yahoo.com.cn

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160124.1900.010.html（2016－01－24）