冀 靜，劉海娟，寧芬茹，左 萍，魏 星，王月玲

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004）

Sox2通過Wnt信號通路對宮頸癌侵襲及遷移能力的影響

冀 靜1，劉海娟2，寧芬茹1，左 萍1，魏 星1，王月玲1

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004）

目的 探討干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響及其機(jī)制。方法 采用RTPCR及Western blot方法分別檢測本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)Sox2的SiHa－Sox2細(xì)胞及對照組SiHa－EGFP細(xì)胞中Sox2的表達(dá)情況；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察Sox2對SiHa細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響；Western blot檢測兩組細(xì)胞中Wnt信號通路關(guān)鍵基因β－catenin的表達(dá)情況。結(jié)果 穩(wěn)定表達(dá)Sox2的SiHa－Sox2細(xì)胞中Sox2 的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加；SiHa－Sox2組細(xì)胞侵襲及遷移能力增強(qiáng)；Western blot檢測結(jié)果顯示β－catenin表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 Sox2通過上調(diào)β－catenin的表達(dá)激活Wnt信號通路，使宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的侵襲及遷移能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

宮頸癌；Sox2；Wnt信號通路；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1128.006.html（2016－02－02）

Sox2（SRY－related high－mobility－group box 2）是胚胎干細(xì)胞一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Sox家族。目前已發(fā)現(xiàn)Sox2基因在肺癌、食管癌、乳腺癌、骨腫瘤、結(jié)腸癌等［1－5］多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Sox2與Wnt信號通路間存在一定相關(guān)性，Sox2可以通過調(diào)控Wnt信號通路的關(guān)鍵基因βcatenin、TCF的活性或Wnt信號通路靶基因如Cyclin D1、c－Myc的表達(dá)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。本實(shí)驗(yàn)前期已通過免疫組織化學(xué)法證實(shí)，Sox2及β－catenin蛋白在浸潤性宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)程度均顯著高于正常組織中的表達(dá)，且二者的表達(dá)具有顯著正相關(guān)性（P＜0.01）［7］，并成功構(gòu)建出高表達(dá)Sox2的宮頸癌Si－Ha細(xì)胞［8］。本研究旨在進(jìn)一步觀察Sox2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，并探討Sox2是否通過調(diào)控Wnt信號通路的活性而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，為宮頸癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 穩(wěn)定高表達(dá)Sox2的Si－Ha－Sox2細(xì)胞及對照組SiHa－EGFP細(xì)胞由本課題組成員前期構(gòu)建［8］。胎牛血清購自Hyclone公司，DMEM（High Glucose）培養(yǎng)基購自Sigma公司，RNAfast200提取試劑盒購自陜西先鋒生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶均購于TaKaRa公司，鼠抗人β－actin單克隆抗體、兔抗人Sox2單克隆抗體、兔抗人β－catenin單克隆抗體均購自Eptomics公司，HRP－山羊抗兔蛋白抗體、HRP－山羊抗鼠蛋白抗體購自Proteintech Group公司，Western blot制膠試劑盒、DNA Marker均購自天根生物科技有限公司；蛋白Marker購自Fermentas公司，ECL發(fā)光液購自碧云天生物公司，RIPA蛋白裂解液、Mataigel基質(zhì)膠均購自西安沃爾森生物公司，Transwell小室購自Corning公司。PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含100mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80％以上時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.3 RT－PCR檢測細(xì)胞Sox2 mRNA表達(dá) 按RNAfast200提取試劑盒說明分別從SiHa－Sox2和Si－Ha－EGFP細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，隨后按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)的引物為：Sox2上游引物：5′－GTTGAATTCTACAACATGGAGA－3′，下游引物：5′－GTTGGATCCCGGTATTTATAATCCGGGTGC－3′；β－actin上游引物：5′－CCAGAGCAAGAGAGGCATCC－3′，下游引物：5′－CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG－3′。反應(yīng)條件：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃1min （35個(gè)循環(huán)）；72℃10min。20g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察并照相。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 分別取對數(shù)生長期的SiHa－Sox2、SiHa－EGFP細(xì)胞，4×104個(gè)/孔接種于24孔板中，置于37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，用200μL槍頭垂直均勻用力劃線，每孔約劃3～4條線，再用PBS沖洗3遍后，每孔加入1mL無血清培養(yǎng)液，將24孔板放于倒置顯微鏡下觀察并照相；將細(xì)胞重新放回37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后同樣的方法觀察并照相。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將0.05g/L 的Mataigel基質(zhì)膠按1∶8的比例稀釋，每個(gè)小室用60μL鋪于基底膜的上室面，置于室溫風(fēng)干；吸取培養(yǎng)板內(nèi)殘余的液體，每孔加入50μL含10g/L的牛血清白蛋白（BSA）無血清培養(yǎng)液，37℃放置30min。

分別取對數(shù)生長期的SiHa－Sox2、SiHa－EGFP細(xì)胞，用含10g/L的BSA無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每個(gè)Transwell小室內(nèi)加200μL細(xì)胞懸液；在24孔板下室內(nèi)加入500μL含100mL/L FBS的培養(yǎng)液，并將Transwell小室置于培養(yǎng)板中，置于37℃，50mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；取出小室，用棉簽擦去PVPF膜靠近小室內(nèi)面的細(xì)胞后，用950 mL/L的乙醇常溫固定30min，結(jié)晶紫染色20min，清水沖洗3遍，放于倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.6 Western blot檢測Sox2及β－catenin蛋白表達(dá)SiHa－Sox2、SiHa－EGFP細(xì)胞長滿100mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿后，按RIPA蛋白裂解液說明提取細(xì)胞總蛋白。蛋白液中加入上樣緩沖液后煮沸5min。100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50g/L脫脂牛奶封閉1h后，加入一抗：兔抗人Sox2單克隆抗體（1∶200），兔抗人β－catenin單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜。洗脫一抗后加入HRP－山羊抗兔lgG抗體（1∶2 000），37℃孵育1h。于暗室中加入適量ECL發(fā)光液，置于蛋白凝膠成像系統(tǒng)上顯影成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間差異比較采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR及Western blot檢測Sox2的表達(dá)變化對前期實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建Sox2高表達(dá)的宮頸癌SiHa－Sox2細(xì)胞及對照組SiHa－EGFP細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，Si－Ha－Sox2細(xì)胞中Sox2的mRNA、蛋白水平均明顯高于對照組SiHa－EGFP細(xì)胞（圖1A、1B），說明前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)Sox2基因的SiHa細(xì)胞株成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Sox2在宮頸癌SiHa－EGFP、SiHa－Sox2細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1The expression of Sox2in SiHa－Sox2cells and the control cells

2.2 Sox2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可見（圖2），24h后SiHa－Sox2細(xì)胞組的劃痕寬度明顯小于SiHa－EGFP細(xì)胞組，提示SiHa－Sox2的細(xì)胞遷移能力明顯強(qiáng)于對照組SiHa－EGFP細(xì)胞；依據(jù)（D0h－D24h）/D24h（D為劃痕寬度）計(jì)算愈合能力（細(xì)胞遷移能力），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.00）。

2.3 Sox2對宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，SiHa－EGFP組的每小室侵襲細(xì)胞數(shù)為88.50±3.40，而SiHa－Sox2組為176.25±4.63（圖3）。實(shí)驗(yàn)表明，SiHa－Sox2細(xì)胞較SiHa－EGFP細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 Sox2對Wnt信號通路關(guān)鍵基因β－catenin表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，SiHa－Sox2細(xì)胞中β－catenin的表達(dá)明顯高于對照組SiHa－EGFP細(xì)胞（圖4）。

圖2 Sox2對宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移能力的影響Fig.2The effect of Sox2on the invasion capacity of SiHa cells

圖3 Sox2對SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.3The effect of Sox2on the migration capacity of SiHa cells

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居女性惡性腫瘤第二位。宮頸癌具有很強(qiáng)的侵襲力，其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生存，但其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不完全清楚。研究認(rèn)為腫瘤的微生態(tài)、細(xì)胞因子及多條信號通路均可能參與其中，另外腫瘤干細(xì)胞的存在也是其高侵襲轉(zhuǎn)移的原因之一。

圖4 Western blot檢測β－catenin表達(dá)的變化Fig.4Expression ofβ－catenin in SiHa－Sox2and SiHa－EGFP cells detected by Western blot

Sox2基因是胚胎干細(xì)胞一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其對腫瘤干細(xì)胞的自我更新及維持也起著重要作用。目前已在多種實(shí)體腫瘤發(fā)現(xiàn)Sox2基因高表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，Sox2在腫瘤中同時(shí)調(diào)控著大量下游分子的表達(dá)及活性，才能在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)通路中發(fā)揮重要作用。LI等［9］通過多種實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)，在乳腺癌及前列腺癌中，Sox2通過激活Wnt信號通路，影響其下游基因DKK3、DVL1及DVL3的表達(dá)，促進(jìn)上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而增強(qiáng)乳腺癌及前列腺癌的侵襲、遷移能力。LAI等［10］通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC－MS）篩選出乳腺癌MCF－7細(xì)胞中與Sox2結(jié)合的蛋白，其中包含Wnt信號通路關(guān)鍵基因β－catenin，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也提示二者之間存在相互作用。但尚無明確報(bào)道Sox2在宮頸癌中是否對腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移有影響。

在作者前期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Sox2及Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白β－catenin在浸潤性宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)程度均顯著高于正常宮頸組織，且二者的表達(dá)具有顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），提示在宮頸鱗癌中高表達(dá)的Sox2基因可能通過調(diào)控Wnt信號通路共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展［7］，然而其具體相互作用的機(jī)制尚不明了。因此，在作者前期的研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)首先采用RT－PCR及Western blot法驗(yàn)證了前期獲得的Sox2過表達(dá)的SiHa－Sox2細(xì)胞及對照SiHa－EGFP細(xì)胞中Sox2mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組SiHa－EGFP相比，SiHa－Sox2細(xì)胞中Sox2的mRNA及蛋白水平表達(dá)量均明顯增高，提示前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的過表達(dá)Sox2的SiHa－Sox2細(xì)胞及對照SiHa－EGFP細(xì)胞成功。隨后對兩組細(xì)胞分別進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SiHa－Sox2組細(xì)胞較SiHa－EGFP細(xì)胞的侵襲及遷移能力均明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Sox2促進(jìn)了宮頸癌SiHa細(xì)胞的侵襲及遷移。這一研究結(jié)果同SUN等［11］在肝癌細(xì)胞中Sox2增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力的報(bào)道一致，另外XU［12］和LOU等［13］也分別在人絨毛膜細(xì)胞癌及卵巢癌中得到相似的結(jié)果。

作者前期免疫組化結(jié)果顯示，在宮頸癌中Sox2高表達(dá)同β－catenin高表達(dá)存在顯著相關(guān)性，提示Sox2基因可能是通過調(diào)控Wnt信號通路的活性進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用Western blot檢測了SiHa－Sox2及SiHa－EGFP細(xì)胞中Wnt信號通路關(guān)鍵基因β－catenin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SiHa－Sox2細(xì)胞中β－catenin表達(dá)明顯高于SiHa－EGFP細(xì)胞，提示在宮頸鱗癌中Sox2可能是通過上調(diào)β－catenin的表達(dá)激活調(diào)控Wnt信號通路的活性，從而促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了上調(diào)Sox2基因可以增強(qiáng)人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的侵襲及遷移能力；這一作用可能通過上調(diào)β－catenin的表達(dá)進(jìn)而激活Wnt信號通路而實(shí)現(xiàn)。本研究為以Sox2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的宮頸癌治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，抑制Sox2的表達(dá)有望成為一種治療宮頸癌的新途徑。

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（編輯 國 榮）

Effect of Sox2on invasion and migration of cervical cancer via Wnt signaling pathway

JI Jing1，LIU Hai－juan2，NING Fen－ru1，ZUO Ping1，WEI Xing1，WANG Yue－ling1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061；2.Department of Obstetrics and Gynecology，No.4Hospital of Xi’an City，Xi’an 710004，China）

ABSTARCT：Objective To investigate the effects of the transcription factor SRY－related high－mobility－group box 2（Sox2）related to stem cells on the invasion and migration of cervical squamous carcinoma cell line SiHa and its mechanism.Methods The expression of Sox2 was detected in Sox2 stably over－expressed cell line SiHa－Sox2 and negative control SiHa－EGFP cells by RT－PCR and Western blotting，respectively.The effects of Sox2 on the invasion and migration capacities of SiHa cells were detected by wound－h(huán)ealing assay and transwell assay.The expression ofβ－catenin was detected by Western blot.Results Compared with that of SiHa－EGFP cells，the expression of Sox2 at both mRNA and protein levels was obviously upregulated in SiHa－Sox2 cells.The migration and invasion capacities of SiHa－Sox2 cells were increased significantly（P＜0.01），and the expression ofβ－catenin increased dramatically compared with that of the control cells.Conclusion Sox2 promotes the invasion and migration capacities of SiHa cells by increasing the expression ofβ－catenin and activating Wnt signaling pathway，which contributes to the development of cervical cancer.

cervical cancer；SRY－related high－mobility－group box 2（Sox2）gene；Wnt signaling pathway；cell invasion；cell migration

R737.33

A

10.7652/jdyxb201602017

2015－05－12

2015－10－19

國家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（No.81001162）Supported by the National Natural Science Youth Foundation of China（No.81001162）

王月玲.E－mail：yuelingw@163.com