劉 旭，張 瑩，王 彬，劉曉丹，王 豫，曾 妍，潘秀頡，周平坤，朱茂祥，顧永清

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003）

人CAP1蛋白真核表達(dá)及細(xì)胞定位與功能

劉 旭1，2，張 瑩2，3，王 彬1，2，劉曉丹2，王 豫2，曾 妍3，潘秀頡2，周平坤2，朱茂祥2，顧永清2，3

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003）

目的 構(gòu)建CAP1蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒并使之在細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)，確定CAP1蛋白在細(xì)胞中的定位及其對細(xì)胞遷移的影響。方法 以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，經(jīng)PCR獲取CAP1編碼區(qū)cDNA，將該編碼區(qū)cDNA序列插入pCMV－Myc質(zhì)粒中，構(gòu)建帶Myc標(biāo)簽的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，Western blot方法檢測其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，免疫熒光法檢測其細(xì)胞內(nèi)的定位，劃痕實驗觀察其對細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果 成功構(gòu)建了CAP1真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，確定CAP1定位于細(xì)胞質(zhì)中，劃痕實驗證明CAP1過表達(dá)的細(xì)胞遷移能力明顯下降。結(jié)論 在真核細(xì)胞中成功表達(dá)了CAP1重組質(zhì)粒且CAP1定位于細(xì)胞質(zhì)，其過表達(dá)對細(xì)胞遷移有抑制作用，為研究CAP1的生理功能奠定實驗基礎(chǔ)。

細(xì)胞骨架；肌動蛋白；CAP1；亞細(xì)胞定位；細(xì)胞遷移；重組質(zhì)粒

細(xì)胞骨架在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、胞質(zhì)分裂、胞吞作用、細(xì)胞遷移等諸多方面發(fā)揮作用。細(xì)胞骨架異常會誘發(fā)包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種人類疾病，并可影響腫瘤轉(zhuǎn)移。肌動蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分，單體肌動蛋白與多聚肌動蛋白間的動態(tài)平衡在細(xì)胞骨架調(diào)控系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用［1－2］。因而肌動蛋白的聚集/解離機制引起研究者的廣泛關(guān)注，并有研究發(fā)現(xiàn)CAP1（adenylyl cyclase－associated protein 1）有重要作用。CAP1是一類廣泛存在于真核生物的保守蛋白［3］，在酵母中是腺苷酸環(huán)化酶復(fù)合物的組分之一并參與酵母的Ras/cAMP信號通路［4－6］，但在除酵母以外的其他真核生物中并不作用于這一信號通路而是參與肌動蛋白的調(diào)控［3］。在人類肝癌、胰腺癌等多種癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)CAP1的表達(dá)變化，這表明CAP1可能對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵入有潛在影響［7－11］。為了進一步研究人類CAP1蛋白的功能，尤其是在癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制中的潛在作用，本研究構(gòu)建了人類CAP1重組質(zhì)粒，并在細(xì)胞中實現(xiàn)表達(dá)，確定CAP1在細(xì)胞中的定位，并對其在癌細(xì)胞遷移方面的影響做了初步的探討，為研究CAP1蛋白的功能打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV－Myc哺乳動物表達(dá)載體、293細(xì)胞由本實驗室保藏；HeLa細(xì)胞由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐勤枝老師惠贈；DNA高保真聚合酶KODPlus－Neo購自TOYOBO公司；常規(guī)PCR聚合酶2 ×Taq PCR Green Mix購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、NotⅠ及T4連接酶購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒購自東盛公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購自TIANGEN公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；鼠源Myc標(biāo)簽抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗：羊抗小鼠IgG/HRP及鼠源Actin內(nèi)參抗體購自中杉金橋公司；熒光標(biāo)記二抗Alexa Fluor?488 Goat Anti－Mouse IgG（H＋L）Antibody購自Life Technologies公司。引物合成與重組質(zhì)粒的測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 CAP1蛋白ORF序列的擴增 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的CAP1蛋白ORF序列，結(jié)合pCMVMyc載體多克隆位點位置，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增引物序列，并分別在上、下游引物中引入SalⅠ、NotⅠ酶切位點。上、下游引物序列分別為：5′－CGCGTCGACCATGGCTGACATGCAAAATCTG－3′，5′－ATAAGAATGCGGCCGCTTATCCAGCAATTTCTGTCAC－3′。按照KOD－Plus－Neo高保真聚合酶說明書所示建立反應(yīng)體系，運行PCR，獲得目的片段。反應(yīng)條件如下：94℃2min，1個循環(huán)；98℃10s，68℃90s，35個循環(huán)。

1.3 CAP1/pCMV－Myc重組載體的構(gòu)建 前述PCR產(chǎn)物及pCMV－Myc真核表達(dá)載體分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ雙酶切1h，瓊脂糖凝膠電泳后利用試劑盒回收純化。純化后酶切產(chǎn)物再經(jīng)T4連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選菌落PCR陽性者抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定，再選可見2條帶者進行測序，經(jīng)比對正確者即為CAP1重組載體，命名為pCMV－CAP1－Myc，可表達(dá)帶Myc標(biāo)簽的CAP1重組蛋白。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及過表達(dá)蛋白的獲得 于60mm培養(yǎng)皿內(nèi)以無抗生素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293或HeLa細(xì)胞，待單層細(xì)胞生長占比為60％～80％時可進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時取2管，加入無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液50μL，其中1管內(nèi)再加入pCMVCAP1－Myc載體3～5μg，另1管內(nèi)按載體/脂質(zhì)體質(zhì)量體積比1∶2加入LipofectamineTM2000，靜置5min后將兩者輕柔混合，再靜置20min。將混合液均勻滴入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48h。

48h后棄培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS洗2～3次，刮取細(xì)胞至Ep管，4℃、3 500r/min離心5min，棄上清，留沉淀（為獲取的細(xì)胞）。根據(jù)細(xì)胞量加蛋白裂解液60～100μL，冰上裂解10min，移上清至干凈Ep管，將獲取蛋白測濃度后，加Loading Buffer，于沸水中煮沸10min，用于后續(xù)Western blot檢測。

1.5 Western blot檢測 根據(jù)蛋白濃度取40μg上樣，先80V電泳至Marker分開，再120V電泳1.5h （100g/L分離膠）。20V恒壓半干轉(zhuǎn)膜50min，50 g/L脫脂牛奶封閉1h。Myc標(biāo)簽一抗及Actin內(nèi)參抗體按1∶1 000比例稀釋，4℃孵育過夜，羊抗小鼠IgG/HRP二抗按1∶4 000比例稀釋，室溫孵育1h。TBST洗膜，8 min/次，共3次。ECL顯色，檢測CAP1蛋白表達(dá)情況。

1.6 免疫熒光定位分析 將無水乙醇浸泡過夜的蓋玻片鋪于60mm培養(yǎng)皿底，接種HeLa細(xì)胞或293細(xì)胞，待其長至60％融合時轉(zhuǎn)染pCMV－CAP1－Myc質(zhì)粒。48h后取出蓋玻片置于6孔板，4℃預(yù)冷PBS洗3次，40g/L多聚甲醛4℃固定過夜，經(jīng)預(yù)冷PBS清洗后加4℃預(yù)冷2.5mL/L Triton 100破膜，室溫20min，10g/L BSA室溫封閉30min。用10g/L BSA稀釋抗體，Myc一抗1∶200稀釋，熒光二抗1∶1 000稀釋；DAPI用PBS稀釋至終質(zhì)量濃度1μg/mL。以預(yù)冷PBS清洗6孔板3次，向蓋玻片中心滴加Myc標(biāo)簽一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜，預(yù)冷PBS洗3次后滴加熒光二抗，室溫濕盒避光孵育1h，預(yù)冷PBS洗3次，加DAPI染核20min，室溫濕盒內(nèi)避光孵育。取出蓋玻片倒置于透明載玻片上，100mL/L甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 劃痕實驗分析 HeLa細(xì)胞于60mm培養(yǎng)皿內(nèi)生長至70％融合時，分別轉(zhuǎn)染pCMV－Myc空載體和pCMV－CAP1－Myc重組載體5μg，另設(shè)未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞對照組，36h后，用10μL移液器吸頭在皿底劃一平直痕跡，PBS清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，使痕跡內(nèi)無HeLa細(xì)胞貼壁生長，加入新DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，鏡下觀察痕跡區(qū)域細(xì)胞侵入情況。

2 結(jié)果

2.1 CAP1重組載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果 以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得CAP1全長序列，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1 428bp條帶（圖1A），PCR產(chǎn)物、pCMV－Myc質(zhì)粒分別雙酶切后以T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，選取菌落PCR陽性者抽提質(zhì)粒再次雙酶切鑒定，可見3 800bp及1 428bp的2條帶位置正確（圖1B），質(zhì)粒送擎科公司測序后比對，與GenBank數(shù)據(jù)庫完全一致。

圖1 CAP1重組載體的構(gòu)建及鑒定Fig.1Amplification of CAP1recombinant plasmid and its identification by double－enzyme cleavage

2.2 Western blot鑒定CAP1蛋白真核細(xì)胞表達(dá)情況 pCMV－Myc空載質(zhì)粒5μg及pCMV－CAP1－Myc重組載體3μg、5μg分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照組，轉(zhuǎn)染48h，收集細(xì)胞提取全蛋白，在預(yù)期位置可見明顯條帶且轉(zhuǎn)染5μg表達(dá)條帶較轉(zhuǎn)染3μg更為明顯（圖2），可知pCMV－CAP1－Myc重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中可以過表達(dá)。

圖2 CAP1真核細(xì)胞表達(dá)鑒定Fig.2Expression of pCMV－CAP1－Myc in 293cells

2.3 CAP1蛋白細(xì)胞內(nèi)定位分析結(jié)果 以pCMVCAP1－Myc重組載體5μg分別瞬時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，另設(shè)未轉(zhuǎn)染293細(xì)胞對照組。鼠源Myc抗體為一抗，山羊抗鼠綠色熒光二抗特異性結(jié)合Myc一抗，細(xì)胞核以DAP1染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅見細(xì)胞核，未見綠色熒光信號；經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和HeLa細(xì)胞可見明顯綠色熒光信號，且僅存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖3），可知CAP1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察CAP1在細(xì)胞內(nèi)的定位情況Fig.3Intracellular location of CAP1observed under the confocal microscope（×400）

2.4 CAP1蛋白過表達(dá)對細(xì)胞遷移的影響 分別在劃痕后0h及24h拍照，觀察比較劃痕實驗結(jié)果中pCMV－CAP1－Myc重組載體及pCMV－Myc空載體及未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示24h后未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pCMV－Myc空載體的HeLa細(xì)胞劃痕與CAP1過表達(dá)的HeLa細(xì)胞劃痕相比，寬度更窄，提示CAP1過表達(dá)的HeLa細(xì)胞24h內(nèi)遷移能力明顯下降（圖4）。

圖4 CAP1影響HeLa細(xì)胞遷移情況Fig.4CAP1overexpression led to degressive migration and invasion of HeLa cells（×200）

3 討論

肌動蛋白形成的纖維狀聚合物和各種調(diào)控蛋白交錯連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架在維持真核細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)運輸、變形運動及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［12］。多種腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞骨架均存在異常，這種異常既表現(xiàn)為肌動蛋白聚合物的結(jié)構(gòu)異常，也表現(xiàn)為相關(guān)調(diào)控蛋白的狀態(tài)異常。

CAP1基因位于人類1號染色體，包含14個外顯子，ORF框長度為1 428bp，編碼1個約55ku的蛋白質(zhì)，該蛋白序列保守，但在不同物種中行使不同的調(diào)控功能，在酵母細(xì)胞中參與Ras/cAMP信號通路調(diào)控，在其他物種包括人類細(xì)胞中主要作為細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白。有研究表明，在肝癌、胰腺癌等多種癌細(xì)胞中，CAP1存在表達(dá)上調(diào)并推測可能促進細(xì)胞遷移［7］，另有報道稱其在肺癌細(xì)胞中存在生化性質(zhì)轉(zhuǎn)變并具有作為顱內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)志物的潛在應(yīng)用前景［13］。由此推測，CAP1在人類細(xì)胞中除了已知的細(xì)胞骨架調(diào)控功能外，可能還有其他功能，并且當(dāng)細(xì)胞癌變時，這些已知和/或未知的功能會發(fā)生變化。

為了深入研究CAP1的生理功能，本研究構(gòu)建了CAP1的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)。通過免疫熒光實驗分析，可知CAP1主要定位于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，這與其作為細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白的功能是相一致的。同時令人意外的是，在CAP1過表達(dá)HeLa細(xì)胞的劃痕實驗中，CAP1的過表達(dá)變化對細(xì)胞遷移效率產(chǎn)生了明顯的抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)尚屬首次，很可能體現(xiàn)了CAP1的某些未知功能。

本研究對以CAP1蛋白為切入點，為揭示細(xì)胞尤其是癌細(xì)胞骨架蛋白的生物活性、功能及調(diào)控機制提供了實驗基礎(chǔ)。CAP1的進一步研究對掌握癌細(xì)胞的生理生化特性，諸如骨架結(jié)構(gòu)形態(tài)或動態(tài)特征的改變、相關(guān)調(diào)控因素的變化等方面提供了一個可行的思考方向，最終為通過檢測CAP1蛋白功能指標(biāo)或人為改變CAP1蛋白性質(zhì)，以達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)或治療某些腫瘤。

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The eukaryotic expression，intracellular location and functions of human CAP1

LIU Xu1，2，ZHANG Ying2，3，WANG Bin1，2，LIU Xiao－dan2，WANG Yu2，ZENG Yan3，PAN Xiu－jie2，ZHOU Ping－kun2，ZHU Mao－xiang2，GU Yong－qing2，3
（1.College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi 832003；2.Institute of Radiology and Radiation Medicine，the Chinese Academy of Military Medicine，Beijing 100850；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Objective To construct the recombinant eukaryotic expression plasmids of human adenylyl cyclase－associated protein1（CAP1）and to explore its intracellular location and functions.Methods By using Hela cDNA as the template，the cDNAs encoding CAP1 was amplified by PCR and inserted into pCMV－Myc vector to construct the recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transfected into 293 cells using lipofectamine 2000.The protein expression and the intracellular location of the inserted gene were confirmed by Western blotting and immunofluorescence，respectively.Scratch－repair experiment was used to detect the cancer cells’migration ability.Results The recombinant eukaryotic expression plasmid of human CAP1 was successfully constructed and transfected into eukaryote cells.The recombinant plasmid was successfully expressed in eukaryote cells.CAP1 was located in the cytoplasm.The results of scratch－repair experiment showed that the overexpression of CAP1 could significantly inhibit the cells’migration.Conclusion CAP1 recombinant plasmid was successfully expressed in eukaryotic cells.CAP1 protein was located in the cytoplasm.The overexpression of CAP1 inhibited cell migration.The present study provides important experimental evidence for further study on CAP1.

cytoskeleton；actin；adenylyl cyclase－associated protein 1（CAP1）；subcellular localization；cell migration；recombinant plasmid

R34

A

10.7652/jdyxb201602010

2015－03－03

2015－11－01

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.30960093，31160183，31270894，31470827）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.30960093，31160183，31270894and 31470827）

顧永清.E－mail：yqgu96@163.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160122.1819.018.html（2016－01－22）